Fare Beyin Damarlarının İzole Edilmesi: Murin Beyin Örneğinden Sağlam Damarları İzole Etmek İçin Bir Protokol

Beyin damarları, sıkıca bağlı endotel hücrelerinden oluşan bir tabaka ile çevrilidir. Bu hücrelerin etrafında, perisitler ve astrositler gibi hücresel bileşenlerle birlikte bir bazal zar bulunur.

Beyin damarlarını çevredeki nöronlardan ve glial hücrelerden izole etmek için, bir homojenizasyon tamponuna batırılmış fare beyni içeren bir beher alın. Küçük parçalar halinde kıyın. Beyin dokusunu ayrıştırmak için homojenize edin, nöronları, glial hücreleri ve beyin damarlarını serbest bırakın. Bu tedavi aynı zamanda nöronları çevreleyen miyelin kılıfını da bozar.

Homojenatı bir tüpe aktarın ve kapları peletlemek için santrifüjleyin. Nöronlar ve glial hücreler gibi daha hafif bileşenler süpernatantta kalırken, miyelin peleti çevreleyen yoğun bir arayüz tabakası oluşturur.

Süpernatanı atın ve uygun yoğunluk gradyan ortamında bağlı miyelin tabakası ile damar peletini yeniden süspanse edin. Damarları peletlemek için santrifüjleyin ve süpernatantın tepesinde yüzen yağ açısından zengin bir miyelin bandı elde edin. Miyelin bandını kullanılmış ortamla birlikte çıkarın ve peleti yeni bir tamponda yeniden süspanse edin.

Ham kap hazırlığını, kapların içinden geçemeyeceği kadar küçük bir filtre içeren bir filtre tertibatı kullanarak süzün. Filtreyi tampon çözelti içeren taze bir behere aktarın. Kapları ayırmak için filtre kağıdını nazikçe kazıyın ve daha fazla analiz için saklayın.

Cildi farenin boynundan burnuna kadar kesmek için bir neşter kullanın ve cildi geri çekin. Kirletici tüyleri temizlemek için kafatasını PBS ile yıkayın ve ardından koku alma ampullerinin önüne kafatasına bir makas yerleştirin. Kafatasını iki parçaya ayırmak için makası açın ve beyni bir spatula ile çıkarın.

Daha sonra, koroid pleksusu lateral ventriküllerden ayırın ve beyni buz üzerinde 20 mililitre B1 çözeltisi içeren 150 mililitrelik bir behere aktarın. Ardından, beyni kuvvetlice 2 milimetrelik doku parçalarına ayırmak için iki neşter kullanın ve dokuyu buz üzerinde 400 rpm'de 20 vuruş boyunca homojenize etmek için otomatik bir Dounce homojenizatör kullanın.

Kapları saflaştırmak için homojenatı 50 mililitrelik plastik bir tüpe aktarın ve doku bulamacını sallanan bir rotor santrifüjünde döndürün. Damar peletinin üst kısmında çoğunlukla miyelinden oluşan büyük beyaz bir arayüz oluşacaktır. Süpernatanı atın.

20 mililitre buz gibi soğuk B2 solüsyonu ekleyin ve tüpü 1 dakika kuvvetlice çalkalayın. İkinci bir santrifüjlemeden sonra, miyelin süpernatantın yüzeyinde yoğun beyaz bir tabaka oluşturacaktır. B2 çözeltisinin dökülürken duvar boyunca akmasına izin vermek için tüpü yavaşça döndürün ve miyelini süpernatan ile birlikte atın.

Ardından, tüpün duvarlarından kalan sıvıyı çıkarmak için emici kağıda sarılmış plastik bir pipet kullanın, kap peletine dokunmamaya dikkat edin ve tüpü buz üzerinde ters çevirin. Daha sonra, peleti 1 mililitre buz gibi soğuk B3 çözeltisi içinde yeniden süspanse edin, ardından damarların agrega oluşturmamasına dikkat ederek 5 mililitre başka bir B3 çözeltisi ekleyin.

Şimdi, bir Becker şişesinin üzerine 20 mikronluk bir naylon ağ filtre yerleştirin ve filtreyi 10 mililitre buz gibi soğuk B3 çözeltisi ile dengeleyin. Kap hazırlığını filtrenin üzerine dökün ve kapları 40 mililitre buz gibi soğuk B3 solüsyonu ile dikkatlice durulayın.

Ardından, filtreyi hemen 30 mililitre taze B3 çözeltisi içeren bir behere aktarmak için temiz forseps kullanın ve kapları filtreden hafifçe çalkalayarak takın. Beher içeriğini 50 mililitrelik plastik bir tüpe dökün. Daha sonra, bir santrifüjlemeden sonra, peleti 1 mililitre buz gibi soğuk B3 çözeltisinde yeniden süspanse edin.