JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 4:21 dk. • July 8th, 2025
Serebellar granül hücreleri, beynin en bol bulunan nöron türüdür. Dış granüler tabaka, EGL, yalnızca, iç granüler tabakayı, IGL'yi oluşturmak için farklılaşan ve içe doğru göç eden granüler hücre öncülerinden, GCP'lerden oluşur.
Granüler hücre gelişimini görselleştirmek için, bir Petri kabının tabanına bir anot takarak bir elektroporasyon odası hazırlayın. Elektrodu kaplamak için kültür ortamı ekleyin. Şimdi, orta kaplı elektrot üzerine bir kültür eki yerleştirin. Civciv embriyosu beyincik dilimlerini sagital oryantasyonda kültür ekine aktarın.
Sagital düzlem, hedef katman-EGL'nin farklı beyincik katmanlarına karşı tanımlanmasını sağlar. EGL üzerine bir GFP plazmit DNA'sı içeren viskoz bir boya çözeltisi ekleyin. GFP plazmit DNA'sı, hücre sitoplazması içinde homojen bir şekilde dağılan ve canlı hücre görüntülemeyi mümkün kılan yeşil bir floresan proteini kodlar.
Daha sonra, ortama EGL'nin yakınına bir katot yerleştirin, ancak doğrudan dokunun üzerine değil. Ardından, farklı EGL bölgelerine birden fazla elektrik darbesi uygulayın. Elektrik darbeleri, hücre zarında geçici gözeneklere neden olarak hücrelerin plazmit DNA'sını almasına izin verir. Daha sonra, plazmit DNA, granüler hücrelerde GFP ekspresyonunu sağlar.
Hücre gelişiminin farklı aşamalarında granüler hücre farklılaşmasını ve göç modelini gözlemlemek için serebellar dilimleri bir floresan mikroskobu altında görüntüleyin.
Bir elektroporatörün anotunu yalıtım bandı kullanarak 60 milimetrelik bir Petri kabının tabanına sabitleyerek bir elektroporasyon odası oluşturun. Elektrodu kaplamak için yaklaşık 1 mililitre HBSS ekleyin. Ardından, HBSS ile kaplanmış elektrotun üzerine 0.4 mikrometrelik bir kültür eki yerleştirin.
Belirlenen dilimleri kültür ekine uç başına en fazla 5 olacak şekilde aktarmak için kesik uçlu 3 mililitrelik bir Pasteur pipeti kullanın. Ardından, dilimleri ayırın ve sagital bir oryantasyonda kültür ekine yerleşmelerine izin verin. Bir pipet kullanarak, fazla ortamı beyin dilimlerinden çıkarın. Ek ile elektrot arasında temas olacak şekilde ek parçanın elektrot üzerinde durmasına izin verin.
Bu kurulumda, dilimlerle birlikte kültür eki, devreyi koruyarak ancak katodun uzamsal hedeflemesine izin vererek ortamın yüzeyine dayanacaktır. Bir P10 pipet ucu kullanarak, %20 Fast Green ile seyreltilmiş 5 mikrolitre DNA'yı her dilimin hedeflenen bölgesinin yüzeyine pipetleyin. Fast Green ilavesi, DNA çözeltisinin DNA'nın geniş dağılımını engelleyecek kadar viskoz olmasını sağlar.
Ardından, katodu istenen hedeflenen dokunun üzerine yerleştirin ve numuneleri elektroporate edin. Katodu dokuya dokunmadan mümkün olduğunca yakın yerleştirerek katodun doku ile doğrudan temasından kaçının. Elektroporasyonu, her bir serebellar dilim üzerinde dış granüler tabakanın birden fazla bölgesinde istenildiği gibi tekrarlayın.
Bittiğinde, kültür ekini 30 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Her kültüre, kültür ekinin altına 1 mililitre önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin. Ek parçanın ortam üzerinde yüzmediğinden emin olun. Kültür eki ortamla temas halinde olmalı, ancak dilimler içinde yıkanmamalıdır.