JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 5:43 dk • July 8th, 2025
İstenilen plazmit çözeltisini içeren bir cam pipet alarak elektroporasyona başlayın. Elektrotun mikropipete yerleştirildiğinden emin olarak, gümüş tel elektrotla donatılmış bir mikropipet tutucusuna takın. Yapay beyin omurilik sıvısına batırılmış ultra ince bir hipokampal bölüm içeren bir elektroporasyon odası alın.
Sonraki elektroporasyon için toprak elektrodunu haznede bulunan sıvıya batırın. Pipet ucunu elektroporasyon odasına indirin ve taban çizgisi direncini kaydedin. Pipet ucunu hedef hücrenin yakınına yerleştirmek için bir mikroskop kullanın. Pipet nöronal membran ile temas ettiğinde, direnci keskin bir şekilde artar.
Nöronal membranda küçük bir istila oluşturmak için pozitif hava basıncı uygulayın. Pipet ucu ile membran arasında gevşek bir sızdırmazlık oluşturarak membranı yukarı itmek için hızlı bir şekilde hafif emme uygulayın. Zarı şartlandırmak ve hücre parçalanmasını önlemek için bu işlemi birkaç kez daha tekrarlayın.
Şartlandırmadan sonra, gigaohm conta adı verilen bir zar ile sıkı bir sızdırmazlık oluşturmak için güçlü bir emiş uygulayın. Zarın kapalı alanında geçici gözenekler oluşturmak için elektrik darbeleri kullanın. Bu açıklıklar, plazmitlerin hedeflenen nöronun içine girişini kolaylaştırır. Elektroporasyon sonrası, gözenekler yeniden kapanır ve plazmitleri nöronun içine hapseder.
Elektroporasyon için dilim kültürleri hazırlamak için, ilgilenilen kültür eklerini 900 mikrolitre kültür ortamı ile doldurulmuş 3 santimetrelik ayrı Petri kaplarına aktarın ve kültürleri bir masa üstü karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Daha sonra, taze kültür eklerini 3,5 santimetrelik bir Petri kabında uç başına 1 mililitre dilim kültür ortamı ile en az 30 dakika önceden inkübe edin ve elektroporasyon teçhizatının hatlarını 5 dakika boyunca %10 ağartıcı ile sterilize edin.
Perfüzyonun sonunda, 0.001 milimolar tetrodotoksin içeren filtre ile sterilize edilmiş aCSF ile perfüze etmeden önce hatları iyonize otoklavlanmış su ile en az 30 dakika durulayın. Elektroporatör darbesini eksi 5 voltluk bir genliğe, bir kare darbeye, 500 milisaniyelik bir trene, 50 Hertz'lik bir frekansa ve 500 mikrosaniyelik bir darbe genişliğine ayarlayın. Bir cam pipeti 5 mikrolitre plazmid içeren iç solüsyonla doldurun ve sıkışan kabarcıkları çıkarmak için ucu birkaç kez hafifçe vurun ve hafifçe vurun.
Ucun hasar görmediğini doğrulamak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın ve pipet ucunu elektroda güvenli bir şekilde takın. Uç aCSF ile temas ettiğinde, elektroporatörün pipet direnci okumasını kaydedin. Bir dilim kültürünü izole etmek için, kültür ekleme zarını keskin bir bıçakla kesin ve dilim kültürünü elektroporasyon odasına dikkatlice aktarmak için keskin açılı forseps kullanın. Ardından, kültür konumunu bir dilim ankraj ile sabitleyin.
İlgilenilen hücrelerin elektroporasyonu için, pipete ağızdan pozitif basınç uygulayın ve pipet ucunu dilim kültürünün yüzeyine yakın bir yere hareket ettirmek için üç boyutlu düğme kontrollerini kullanın. Kültürü mikroskopla görüntüleyerek, hücre yüzeyinde bir çukur oluşana kadar uygulanan pozitif basıncı koruyarak hedef hücreye uç ile yaklaşın. Çukurun görüntülenmesi üzerine, pipet ucu ile plazma zarı arasında gevşek bir sızdırmazlık oluşması için ağızdan hızlı bir şekilde hafif negatif basınç uygulayın.
Membran pipete hafifçe girecektir. Hoparlörlerden gelen tondaki artışla gösterildiği gibi, pipetin ilk direncinde yaklaşık 2,5 katlık bir artış gözlemlenmelidir. Çukurun reform yapması için hızlı bir şekilde pozitif basınç uygulayın. Ardından, az önce gösterildiği gibi duraklamadan hemen en az iki basınç döngüsü daha tamamlayın. Son basınç darbesinden sonra negatif basıncı 1 saniye basılı tutun. Hoparlörlerden gelen ton, perdede sabit bir tepeye ulaşır. Elektroporatörü hızlı bir şekilde vurmak için ayak pedalını kullanın.
Elektroporasyondan sonra, pipeti basınç uygulamadan hücreden yaklaşık 100 mikron uzağa nazikçe geri çekin ve pozitif basıncı yeniden uygulayın, böylece direncin bir sonraki hücreye yaklaşmadan önce temel okumaya benzer olduğunu doğrulayın. İlgilenilen tüm hücreler elektroporasyona tabi tutulduğunda, dilim kültürünü hazırlanan taze kültür eklerinden birine aktarın ve eki 3 güne kadar 35 santigrat derecede yerleştirin.