Omurilik Nöron İzolasyonu: İn Vitro Çalışmalar için Yenidoğan Omurilik Nöronlarını İzole Etmek İçin Bir Yoğunluk Gradyan Prosedürü

Omurilik nöronlarını izole etmek için, yenidoğan bir farenin vertebral kolonunu alın ve bir Petri kabına yerleştirin. Omuriliği serbest bırakmak için vertebral kolonu salin tamponu ile yıkayın. Hücre sağkalımını desteklemek için omuriliği soğuk nöronal ortama aktarın.

Daha sonra, omuriliği kıyın ve parçaları taze nöronal ortam içeren bir tüpe aktarın. İklimlendirme için tüpü bir çalkalayıcı su banyosunda inkübe edin. İnkübasyondan sonra, harcanan ortamı çıkarın ve sindirim ortamını ekleyin. Sindirim enzimleri, hücreleri gevşetmek için doku matrisini parçalar.

Doku parçalarını pipete aspire ederek ezme işlemi gerçekleştirin ve bileşenleri hızla boşaltın, tek tek hücreleri süspansiyona bırakın. Daha sonra, bu süspansiyonu yoğunluk gradyan ortamı ve santrifüj içeren bir tüpe aktarın.

Santrifüjlemeyi takiben, tüpün yüzeysel tabakası doku kalıntıları içerir. İlk katman oligodendrositleri ve astrositleri içerir. İkinci ve üçüncü katmanlar nöronları içerir ve üçüncü katman en yüksek saflığa sahiptir. Son olarak, pelet mikroglial hücreler içerir.

Üçüncü katmanı yeni bir tüpe toplayın ve yoğunluk gradyan ortamını seyreltmek için nöronal ortam ekleyin. Nöronları peletlemek için santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve daha sonraki deneyler için nöronları korumak için peleti nörobazal bir ortamda yeniden süspanse edin.

Bu işleme başlamak için, makas kullanarak ötenazi yapılmış fare yavrularının kafasını vücudundan ayırın. Daha sonra, kuyruğu ve kolları, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde prosedür masasında sabitleyin. Ardından, kavisli iris makasını kullanarak cildi kesin. Bundan sonra, omuriliği kalçaların hemen üzerindeki bel bölgesinden kesin ve ardından göğüs kafesinin her iki tarafını da keserek vücuttan ayırın.

Fazla dokuyu çıkarmak için numuneleri, 5 mililitre sterilize edilmiş PBS içeren üç adet 10 santimetrelik Petri kabında her biri 10 saniye boyunca sırayla yıkayın. Daha sonra, 5 mililitre sterilize edilmiş PBS ile doldurulmuş 22 gauge bir iğne ve şırıngayı omurganın kaudal ucuna yerleştirin ve kranial olarak yıkayın, böylece kordonun dördüncü bir Petri kabına çıkmasına izin verin.

Omuriliği 15 mililitrelik bir tüpte 5 mililitre HABG ile buz üzerine aktarın. Omuriliği ezmekten kaçının ve diğer yavrular için prosedürleri tekrarlayın. İdeal olarak, sağlıklı nöron izolasyonunu sağlamak için bu işlem bir grup yavru için 30 dakikadan fazla sürmemelidir.

Yoğunluk gradyanını hazırlamak için, dört katmanın her birini dört adet 15 mililitrelik tüpte hazırlayın. Ardından, her katmandan 1 mililitreyi 15 mililitrelik yeni bir tüpe ekleyin. En alttaki katman 1 ile başlayın ve en üstteki katman 4'e ulaşana kadar sırayla ekleyin. Eklerken katmanları rahatsız etmekten ve karıştırmaya neden olabilecek kuvvetli hareketlerden kaçının. Daha sonra, sindirim ortamını kıyılmış dokuya ekleyin. Numuneyi 30 santigrat derecede su banyosunda bir çalkalayıcıya yerleştirin. Daha sonra, dokuyu su banyosundan çıkarın ve birkaç dakika oturmasına izin verin.

Öğütme işlemini gerçekleştirmek için fazla sindirim ortamını aspire edin. Dokuyu 2 mililitre HABG'de askıya alın. Dar delikli bir pipet kullanarak, 45 saniyede 10 kez ezme işlemi yapın ve canlı verimi önemli ölçüde azaltacağı için hava girmesinden kaçının. Tritürasyon, prosedürün en kritik adımlarından biridir. Doku, ateşle parlatılmış pipetin içine dikkatlice çekilmeli ve boşaltılmalı, nöronal ölüme yol açabilecek aşırı canlılıktan kaçınılmalı veya çok yumuşak olmalı, bu da düşük verimle sonuçlanacaktır.

Bunu takiben, süpernatantın üst 2 mililitresini aspire edin ve "toplama" etiketli 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. 6 mililitre süpernatan elde etmek için toplama prosedürlerini iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra, toplama tüpü içeriğini, gradyanın bozulmasını önleyerek daha önce hazırlanmış olan gradyan tüpüne yavaşça aktarın.

Nöronları saflaştırmak için, gradyan tüpünü 800 x g ve 22 santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. İstenilen katmanları toplayın ve bunları 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. En yüksek saflıkta nöron izolasyonu için katman 3'ü toplayın. Daha az saflıkta daha fazla verim için 2 ila 3. katmanları toplayın.

Daha sonra, yeni toplanan katmanlara 5 mililitre HABG ekleyerek yoğunluk gradyanını seyreltin. 22 santigrat derecede 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. 2 dakika sonra, süpernatanı atın ve peleti hafifçe vurarak hücreleri 5 mililitre HABG içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra, numuneyi tekrar 22 santigrat derecede 2 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı atın ve peleti hafifçe vurarak hücreleri 3 mililitre nörobazal ortamda yeniden süspanse edin.