Kardiyopulmoner Kompleks Decellularizasyon: Murin Modelinden Kalp ve Akciğerleri Hücreden Arındırma Tekniği

Hücreden arındırma, organları hücresel bileşenlerinden yoksun bırakır ve ECM yapısını sağlam bırakır. Bu, organların 3D mimarisinin korunmasına yardımcı olur. Hücreden arındırma prosedürü için, ötenazi yapılmış bir fareyi sırtüstü pozisyona getirin. Fareyi inceleyin ve kardiyopulmoner kompleksi ortaya çıkarın.

Aort damarı ve pulmoner dolaşımın ana damarları dışında kalpten çıkan tüm büyük damarları bağlayın. Bu adım, sonraki perfüzyon prosedürü sırasında sıvı sızıntısını önler. Soluk borusunda bir açıklık oluşturun ve bu açıklıktan bir kateter yerleştirin. Kateter aort arkına ulaşana kadar inen aortu alttan kateterize edin.

Pozisyonlarını sabitlemek için kateterleri dikin ve perfüzyon pompasına bağlayın. Deiyonize su ile perfüzyona başlayın. Aort yoluyla perfüzyon, kanın tüm kalp damar sisteminden verimli bir şekilde çıkarılmasını sağlar. Sonunda, su akciğerlere giden pulmoner artere girer.

Akciğer damar sisteminden kanı tamamen çıkardıktan sonra, su perfüzyonunu durdurun ve hafiften kuvvetliye kadar değişen farklı deterjan solüsyonları ile değiştirin. Bu prosedür, hücre içi bileşenleri serbest bırakan hücreleri parçalayarak kalbin ve akciğerlerin yarı saydam görünmesini sağlar.

Kalan deterjan moleküllerini çıkarmak için deiyonize su ile tekrar perfüze edin. Hücrelerden arındırılmış kardiyopulmoner kompleksi, uzun bir raf ömrü sağlayan antibiyotik içeren solüsyonda saklayın.

Ötenazi uygulanmış farenin göğsünü, karnını ve sırtını saç kesme makinesiyle tıraş ederek başlayın. Alanı% 70 etanol ile dezenfekte edin. Ardından, fareyi polistiren bir tepsiye sabitleyin, ön ve arka ayaklarının yanı sıra başını ve kuyruğunu da uzatın. Mikrocerrahi mikroskobunun altına yerleştirin.

Bir Mayo düz desen makası kullanarak, submandibular bölgeden alt karın bölgesine uzanan bir kutanöz insizyon yapın ve torasik duvarı ve peritonu ortaya çıkarmak için deri altından diseksiyon yapın. Ardından, göğüs duvarının her iki tarafındaki altıncı interkostal boşluk boyunca pektoralis majör ve pektoralis minör kaslarını kesmek için mikrocerrahi makas kullanın.

Sternumu önceki kesikler boyunca düz desen makasıyla kesin. Ardından, sternumu uzun ekseni boyunca keserek bir sternotomi tamamlayın. Kardiyopulmoner kompleksi ortaya çıkarmak için göğüs duvarının her iki tarafını yükseltin ve sabitleyin. Timülü ve çevresindeki yağ dokusunu eklerinden hassas bir şekilde çekerek çıkarmak için yuvarlak uçlu mikro forseps kullanın ve yemek borusunu mikro makasla kesin.

Brakiyosefalik damarları ve brakiyosefalik arteri keskin mikro forseps ile ayırın. Ardından, ligasyonu ve koterizasyonu kolaylaştırmak için sol ortak karotis ve sol subklavyen arterleri alttaki dokudan ayırın. Brakiyosefalik sol ortak karotis ve sol subklavyen arterlerin çıkışının üzerine dikişler yerleştirmek için bir mikro iğne tutucu ve keskin mikro forseps ve 9-0 sütür kullanın. Brakiyosefalik damarları koterize edin.

Mikro makas kullanarak, bağı bölümlere ayırarak bir giriş açın. Soluk borusuna 27 gauge bir kateter yerleştirin ve bronşları bozmamaya dikkat ederek soluk borusu bronşlara dallanana kadar nazikçe itin. 6-0 dikiş kullanarak, kateteri sabitlemek için trakeanın etrafına üç dikiş yerleştirin.

Fareyi 12. torasik omurun yüksekliğinde bölümlere ayırın. İnen aort omurganın önüne doğru uzanır ve burada omurga ile birlikte bölümlere ayrılmalıdır. Aortu retrograd olarak kateterize edin ve kateteri aort arkına ulaşana kadar itin. Bir dikiş kullanarak, kateter ucunun 5 milimetre altından başlayarak aortun etrafına dört dikiş yerleştirin.

Silikon boru ve alt konektörler kullanarak fareyi bir pompa sistemine bağlayın. 15 dakika boyunca dakikada 200 mikrolitre deiyonize su ile perfüz. Ardından, perfüzyon ajanını deiyonize suda seyreltilmiş %0,5 DOC ile değiştirin ve gece boyunca perfüze edin. Ertesi gün, perfüzyon ajanını deiyonize su ve perfüzde seyreltilmiş %0.1 SDS ile değiştirin ve 8 saat boyunca perfüze edin. Ardından, SDS ve DOC'u yıkamak için 24 saat boyunca deiyonize su ile perfüzasyon yapın.

Decellularize kalbi ve akciğerleri, eklerini toraksa bölerek rezeke edin. Dokuyu steril bir kriyotüpte% 1 penisilin-streptomisin ve 4 santigrat derecede 0.3 mikromolar sodyum azid içeren deiyonize suda saklayın.