JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyoloji
0 görüntüleme • 3:38 dk • July 8th, 2025
Fare dilinin sırt yüzeyi, papilla adı verilen, mantar şeklinde, circumvallate ve filiform papilla olmak üzere üç ana tür kabarık çıkıntı ile kaplıdır. Tat tomurcuklarını barındıran epitel siperlerini içeren sirkumvalat papilla veya CVP, bir bağ dokusu tabakası olan lamina propria tarafından desteklenir.
CVP epitelini izole etmek için, sırtüstü pozisyonda ötenazi yapılmış bir fare ile başlayın. Daha sonra, yanakları kesin ve dili ağız boşluğunun tabanından ayırmak için kalın doku bandını - lingual frenulum - inceleyin. Eksize edilen dili, soğutulmuş tampon içeren bir tabağa aktarın.
Sonra, dilin ön kısmını kesin. Dispas ve kollajenaz enzimleri içeren bir sindirim kokteyli, CVP bölgesinin subepitel boşluğuna, epitel ve alttaki dokular arasına dikkatlice enjekte edin. Süspansiyonu bölgeye enjekte ederken iğneyi geri çekin.
Dili uygun süre boyunca inkübe edin. Dispazlar ve kollajenazlar, bağ dokusu içindeki hücre dışı matriks proteinlerini sindirerek CVP epitelinin dokudan ayrılmasını kolaylaştırır. Kuluçkayı takiben CVP bölgesindeki epitelde kesiler yapın.
Gevşemiş epiteli alttaki dokudan nazikçe ayırın. Son olarak, dokunun tüp duvarına yapışmasını önlemek için ayrılan CVP epitelini protein kaplı bir tüpe aktarın. CVP epiteli, daha sonraki sonraki işlemler için saklanabilir.
Yetişkin bir fareye ötenazi yaptıktan sonra, yanakları kesmek ve çeneyi kırmak için büyük steril diseksiyon makası kullanın. Daha sonra dili kaldırın ve dili ağız boşluğunun tabanından ayırmak için lingual frenulumu kesin. Dili kesin ve kalsiyum ve magnezyum içeren steril buz gibi dPBS'de toplayın.
Diseksiyon mikroskobu altında, bir jiletle intermolar çıkıntının hemen ön tarafını keserek ön dili çıkarın ve atın. Ardından, arka dildeki tüyleri ve fazla sıvıyı temizlemek için hassas bir görev mendili kullanın.
Daha sonra, 1 mililitrelik bir şırıngayı 200 ila 300 mikrolitre enjeksiyon enzim çözeltisi ile doldurun ve dairesel papilla veya CVP'nin hemen içine kadar intermolar çıkıntının hemen üzerine 30 gauge, 1/2 inçlik bir iğne yerleştirin. Enzim solüsyonunu CVP'nin altına ve yanal kenarlarına, epitel ve alttaki dokular arasına enjekte edin. Çözelti enjekte edilirken şırıngayı dilden yavaşça ve sürekli olarak çekin.
Dili steril kalsiyum/magnezyum içermeyen dPBS'de oda sıcaklığında tam olarak 33 dakika inkübe edin. Ekstra ince diseksiyon makası kullanarak, epitelde bilateral ve CVP'nin hemen önünde küçük kesikler yapın. Ardından, epiteli ince forsepslerle kaldırarak nazikçe soyun. Hendek epiteli alttaki bağ dokusundan kurtulduktan sonra, FBS ile önceden kaplanmış 2 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.