İzole Fare Embriyolarına Mikro Kabarcıkların Enjeksiyonu: Mikro Kabarcık Kontrast Maddelerini Canlı Murin Embriyolarının Damar Sistemine Verme Tekniği

Mikro kabarcık dağıtımı için, boruya bağlı bir şırıngada gaz halinde bir çekirdek içeren endotel hücresi hedefli lipid kabuklu mikro kabarcıkların düzgün bir süspansiyonu ile başlayın.

Bu tertibatı bir şırınga pompasına yükleyin ve boruya bir cam iğne takın. Şimdi, spesifik endotel hücre reseptörlerini eksprese eden soğutulmuş bir fare embriyosunu, bir stereoskop aşamasına yerleştirilmiş bir tabağa aktarın.

Embriyoyu yumurta sarısı kesesi ve amniyotik zardan nazikçe çıkarın. Kesesi ve plasenta kenarlarını sabitleyin. Kan akışını eski haline getirmek için embriyoyu ılık bir tamponla durulayın. Optimum ultrason dalgası iletimi için embriyoyu önceden ısıtılmış ultrason jeli ile örtün. Fizyolojik koşullarını korumak için tampon ile takviye edin.

Şırınga pompasını kullanarak plasental diskin fetal membran yüzeyindeki uygun bir damara istenen akış hızında mikro kabarcık süspansiyonunu dikkatlice enjekte edin. Enjekte edilen mikro kabarcıklar dolaşım boyunca hareket eder ve kan damarlarını kaplayan endotel hücreleri üzerindeki spesifik reseptörlere bağlanır.

Yüksek frekanslı ultrason dalgalarını embriyoya iletmek için bir ultrason dönüştürücü kullanın. Mikro kabarcıkların yüksek oranda sıkıştırılabilir gaz çekirdekleri, doğrusal olmayan bir şekilde salınmalarına ve gelen dalgalardan farklı frekanslara sahip ultrason dalgalarını saçmalarına neden olur. Bu sinyaller ve dokunun doğrusal sinyalleri dönüştürücüye geri döner.

Dönüştürücü bunları, mikro kabarcık saçılan sinyalleri doku sinyallerinden ayırt eden ve embriyonik kan damarlarının kontrastlı ultrason görüntülerini üreten bir görüntüleme sistemine iletir.

Gerekli hacimde mikro kabarcık stok çözeltisini pipetleyin ve tuzlu su alikotuna ekleyin. Pipetin ucuyla hafifçe karıştırarak karıştırın. Ardından, seyreltilmiş mikro kabarcık çözeltisini temiz bir şırıngaya çekmek için 21 gauge bir iğne kullanın. İğneyi çıkardıktan sonra, şırıngadaki hava kabarcıklarını ortadan kaldırın ve luer ile boruyu takın. Çözeltiyi yavaşça borunun ucuna itin ve herhangi bir hava kabarcığı oluşturmamaya dikkat edin.

Son olarak, şırıngayı, toplam 20 mikrolitrelik bir hacim için dakikada 20 mikrolitre hızında mikro kabarcıkları dağıtmak için ayarlanmış bir şırınga infüzyon pompasına yerleştirin. Borunun ucuna çekilmiş bir cam iğne takın. Pompayı enjeksiyon aşamasına yaklaştırın. Soğutulmuş ortam kabından rastgele bir embriyo seçmek ve çıkarmak için delikli bir kaşık kullanın. Embriyoyu stereoskopun altındaki ultrason sahnesinde bulunan bir diseksiyon kabına yerleştirin.

Ardından, embriyonun en az vaskülarize görünen tarafını bulun. Burası genellikle baş bölgesine bitişik, düşük vaskülarizasyonun olduğu bir alandır. Ardından, embriyoyu içeriden çıkarabilmek için yumurta sarısı kesesini ve amniyotik zarları kesmek veya yırtmak için ince forseps kullanın, ancak daha fazlasını değil. Ardından, kesesi embriyonun etrafından nazikçe hareket ettirin. Daha sonra embriyoyu plasenta ve göbek damarları önde olacak şekilde yan yatırın.

Küçük hamuru parçaları kullanarak diseksiyon kabını stabilize edin. Dört böcek pimi kullanarak, yumurta sarısı kesesini ve plasentanın kenarlarını sabitleyin ve herhangi bir büyük damardan kaçının. Önceden ısıtılmış 45 santigrat derece PBS içeren bir şırınga kullanarak, kanın embriyoya aktığı görülene kadar embriyoyu yıkayın. Umbilikal arter, pulsatil, parlak kırmızı kan ile tanımlanır. Göbek damarı ve onunla ilişkili vasküler ağ daha koyu kana sahiptir ve genellikle plasenta tarafındaki göbek arterinden gelenleri kaplar.

Bu noktada, tabağı enjeksiyonun rahatça yapılabilmesi için konumlandırın. Embriyo canlandıktan sonra, önceden ısıtılmış ultrason jeli ile plasentayı değil, üzerini örtün. Embriyonun etrafındaki hava kabarcıklarını hassas bir şekilde çıkarmak için ince forseps kullanın ve tabağı önceden ısıtılmış PBS ile doldurun. Prosedür boyunca, PBS ve jel şırıngalardaki çözelti seviyesine dikkat edin ve gerektiğinde ısıtma kabına yedek şırıngalar ekleyin.

Daha sonra, cam iğneyi diseksiyon kabının kenarındaki büyük bir hamuru topuna monte edin ve iğne ucunu PBS'ye yerleştirin. Plasental diskin koryonik yüzeyinde, ana daldan makul olduğu kadar uzakta bir damar seçin. Ardından, iğne ucunu damar boyutuna uyacak şekilde kesmek için makas kullanın ve ucu hafif bir açıyla kesin. Camın pürüzlü kenarlarını çıkarmak için yaylı makasın kenarını kullanın.

Şimdi, şırınga pompasını kullanarak, mikro kabarcık çözeltisini dakikada 20 mikrolitre hızla cam iğneye yavaşça enjekte edin, ta ki tüm hava iğne ucundan dışarı atılana ve mikro kabarcıkların PBS'ye serbestçe aktığı görülene kadar. Pompayı durdurun ve 20 mikrolitrelik bir enjeksiyon hacmi için sıfırlayın. Embriyonun damar sistemine hava enjekte etmekten kaçınmak için enjeksiyon iğnesine hava girmesine izin vermeyin.

Cam iğne ucunu plasentadaki seçilen damarın içine nazikçe sokun ve hareketsiz olduğundan emin olun. Stereoskop kafasını sallayın ve ultrason dönüştürücüsünü, embriyo odaklar arasında 6 ila 10 milimetrede eşit şekilde yerleştirilecek şekilde konumlandırın. Ardından, görüntülemeyi başlatın ve mikro kabarcıkların bolus enjeksiyonunu başlatın. Bir dakika sonra, enjeksiyon tamamlandığında, veri toplama adımı için zamanlayıcıyı başlatın.