Sürüntü Bazlı Konjonktival Kommensal Bakteri İzolasyonu: Murin Modelinin Konjonktivasından Kommensal Bakterileri İzole Etme Tekniği

Gözün konjonktivası kommensal bakterileri barındırır. Bu yerli mikroflora, göz zarlarına giren zararlı mikroplara saldırmak için bağışıklık hücrelerini aktive ederek gözü enfeksiyondan korur.

Kommensal bakterileri izole etmek için, anestezi uygulanmış bir fareyi yanal pozisyonda yerleştirin. Uygun bir ortama batırılmış steril bir göz çubuğu alın. Islak çubuk ucunu sol gözün medial konjonktival bölgesine yerleştirin. Göz küresine bastırın ve çeşitli bir kommensal popülasyonu toplamak için swabı konjonktiva boyunca ileri geri hareket ettirin.

Swabı çıkarın ve mikrobiyal zenginleştirme ortamı içeren bir tüpe karıştırın. Bu adım, sıkışan bakterileri swabın pamuk ağından ortama bırakır. Swabı atın ve bakteri üremesinin başlamasını kolaylaştırmak için tüpü inkübe edin.

Göz çubuğu ile aşılanmış zenginleştirilmiş ortamdan birkaç damla istenen desende bir kan agar plakasına dağıtın ve inkübe edin. Ortamda bulunan kazein ve soya peptonları, peptit sentezi için gerekli nitrojeni sağlarken, sodyum klorür ozmotik dengeyi korur.

Kommensal bakteriler, kan ortamında bulunan hemoglobini sindiren hemolizin enzimlerine sahiptir. Bu, agar plakası üzerinde karakteristik bir model oluşturur ve farklı bakterilerin morfolojik olarak farklı koloniler halinde çoğalmasına neden olur. Konjonktivadaki nispi bolluklarını belirlemek için koloni sayısını sayın.

Arka ayak pedini sıkarak farenin uygun şekilde uyuşturulduğundan emin olun. Sadece hareket yoksa devam edin. Bir elinizi anestezi uygulanmış fareleri tutmak için, diğer elinizi ise göz çubuğunu ve kültürü tutmak için atayın. Fareyi kafesten çıkarın ve sol gözü açıkta kalacak şekilde yan yatırılmış şekilde çalışma yüzeyinin üzerine yerleştirin. Eldivenli ellere izopropanol püskürtün ve bir kağıt havluyla kurulayın.

Etiketli bir BHI mikrosantrifüj tüpünün kapağını özel medya taşıma eliyle açın ve tüpü tekrar rafa yerleştirin. Göz çubuğunun pamuk kaplı ucunu BHI'ye batırın. Ardından, fazla sıvıyı çıkarmak ve çıkarmak için ucu iç boruya karşı iki kez döndürürken swabı tüpten çıkarın.

Fareyi tutan eliyle, fareyi boynundan nazikçe tutun. Öte yandan, göz çubuğunun ucunu sol gözün medial konjonktival bölgesine yerleştirin. Göz küresine hafifçe bastırın ve swabı alt göz kapağı ile göz arasında 10 kez pencere yıkama hareketiyle hareket ettirin ve sabit basıncı koruyun. Kürke dokunmadan, swabın ucunu yerleştirildiği yere dik olarak nazikçe çıkarın. Swabı pamuklu tarafı aşağı bakacak şekilde doğrudan BHI ortamı ile etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.

Sürüntü alınan göze bir göz damlası sürün. İstenirse, kontrol numuneleri için deri veya kürk çubukları alın ve eldivenleri her bir çubuk arasında uygun şekilde sterilize edin. İşiniz bittiğinde, fareyi kafese geri koyun. Swabı buz üzerinde 10 ila 15 dakika bekletin. Ardından, eldivenli elleri sterilize edin ve ucu 10 dönüş boyunca ortamda karıştırırken swabı çıkarın. Ucu tüpün iç duvarına beş tur boyunca döndürerek swabı geri çekin ve biyolojik olarak tehlikeli bir kaba atın. Her fare için işlemi tekrarlayın.

Tüpleri 37 santigrat derecede 1 saat statik olarak inkübe ederek numuneyi zenginleştirin. İnkübasyon sırasında, fare göz çubuğu veya kontrol çubuğu başına bir oda sıcaklığında TSA plakasını etiketleyin ve ikiye bölün. Zenginleştirilmiş örnekleri inkübatörden çıkarın ve buzun üzerine koyun. Karıştırmak için örnekleri kısaca girdaplayın. Ardından, numunenin 10 mikrolitresini TSA plakasına alın ve bir şerit oluşturmak için plakayı eğin. Bunu iki kez tekrarlayın.

Plakanın bölme çizgisinin diğer tarafında, her biri 10 mikrolitre numune ile 10 nokta oluşturun. Plakaları 37 santigrat derecede 18 saat, 2 gün ve 4 gün boyunca agar plakalarının kurumasını önleyen temiz bir odada inkübe edin. Şeritlerdeki kolonileri sayın. Morfolojiyi not edin ve morfolojik olarak benzer izolatlar için sürüntü başına koloni oluşturan birimleri hesaplayın.