Fare Valf İnterstisyel Hücrelerinin İzolasyonu: Fare Aort Kapağından VIC'leri İzole Etmek ve Kültürlemek İçin Enzimatik Bir Yöntem

Kalbin aort kapağı, yoğun hücre dışı matris boyunca dağıtılan iç kapak, interstisyel hücreler veya VIC'lerden ve üstteki kapak endotel hücreleri veya VEC'lerden oluşan üç yapraklı bir yapıdır.

VIC'leri izole etmek için önce sırtüstü pozisyonda ötenazi yapılmış bir fare hazırlayın. Orta hat karın ve göğüs kesisinden kalbi açığa çıkarın. Sol atriyum ve ventrikül arasında küçük bir çentik yapın ve ardından kanı boşaltmak için salin perfüzyonu uygulayın. Çıkan aortu aort arkı hizasında kesin ve kalbi çıkarın.

'U şeklindeki' aort kapak broşürlerini ortaya çıkarmak için kalbin kalan kısmını uzunlamasına incelemeden önce ventriküllerin distal üçte ikisini kesin ve atın. Yaprakçıkları kesin ve kanı çıkarmak için soğutulmuş tamponla durulayın.

Daha sonra, broşürleri düşük konsantrasyonlu kollajenaz çözeltisi ile muamele edin ve inkübe edin. Düşük konsantrasyonlarda, proteolitik bir enzim olan kollajenaz, hücre dışı matrisi sadece kısmen parçalayarak yüzey VEC'lerini broşürlerden çıkarır.

Enzim içeren süpernatanı santrifüjleyin ve tamponla değiştirin, yeniden süspanse edilmiş peleti bir Petri kabına aktarın. Broşürleri toplayın ve ikinci sindirim için yüksek konsantrasyonlu kollajenaz çözeltisi ile muamele edin. İnkübasyon üzerine, kollajenaz hücre dışı matrisi daha da bozar ve VIC'leri çözeltiye bırakır.

VIC'leri peletlemek için santrifüjleyin ve uygun ortamda yeniden süspanse edin. Son olarak, VIC'lerin kuyu dibine yapışmasını kolaylaştırmak için çok kuyulu bir plaka üzerine düşük hacimli bir hücre süspansiyonu tohumlayın. VIC'lerin çoğalmasına izin vermek için kuluçkaya yatırın.

Deneye başlamadan önce tüm cerrahi aletleri ve çalışma alanını %70 etanol ile temizleyip sterilize edin ve cerrahi aletleri 30 dakika otoklavda tutun. İlk kurulum hazır olduğunda, 8 haftalık ötenazi uygulanmış bir farenin göğsünü ve karın bölgesini etanol kullanarak temizlemeye başlayın.

Makas kullanarak farenin karnını ve göğsünü açın. Daha sonra sol kulakçık ile sol karıncık arasını küçük bir cerrahi makasla kesin. 10 mililitre soğuk PBS perfüze ederek kalpten kanı çıkarın ve çıkan aortun 3 milimetresini koruyarak kalbi kesin. Stereomikroskop altında, kalbi ventriküllerin ortasında yatay olarak keserek ve sol ventrikülü aorta doğru keserek aort kapağını inceleyin. Ardından, aort kapağını dikkatlice inceleyin. Valfleri 35 milimetrelik küçük bir doku kültürü kabında bir araya getirin.

İzole edilmiş valfleri 75 mililitrelik bir hücre kültürü kabında 5 mililitre taze hazırlanmış 10 milimolar soğuk HEPES ile antibiyotiklerle yıkayın ve 5 mililitre kollajenaz tip I içinde sürekli çalkalama ile 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpü 150 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve peleti bir kez 2 mililitre milimolar HEPES ile 30 saniye boyunca yüksek hızda girdaplama ile yıkayın.

Elde edilen süspansiyonu tüpten 35 milimetrelik bir kültür kabına toplayın ve doku parçalarını dikkatlice yeni bir tüpe aktarmak için ince cımbız kullanın. Daha sonra, peleti 15 mililitrelik bir tüpte, 37 santigrat derecede 37 mililitre kollajenaz tip I'de 35 dakika boyunca sürekli çalkalama altında inkübe edin. Hücreleri 1 mililitrelik bir pipetle yeniden süspanse ederek ayırın ve 150 x g'da 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Ayrılan peleti 2 mililitre tam DMEM içinde yeniden süspanse ederek ve 150 x g'da 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyerek hücreleri iki kez temizleyin.

Kaplama için, peleti 1 mililitre tam ortamda yeniden süspanse edin ve minimum miktarda ortamda 6 oyuklu bir hücre kültürü kabının bir oyuğuna ekleyin. Plakaları% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede rahatsız etmeyin. 3 günlük inkübasyondan sonra, hücreleri mikroskop altında gözlemleyerek doku kalıntılarına daha yakın büyümeyi doğrulayın. 1.000 hücre göründüğünde, doku kalıntılarını otoklavlanmış cımbızla dikkatlice çıkarın ve ortamı değiştirin.