$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bir memeli yumurtalığında, antral foliküllerden türetilen tamamen büyümüş oositler, in vitro embriyogenez için çok önemli bir faktör olan kültürde sadece kısa bir olgunlaşma dönemine ihtiyaç duyar. Bu oositler, sperm enjeksiyonunu kolaylaştırmak için denudasyon yoluyla çıkarılması gereken bir somatik hücre kümesi ile çevrilidir.
Denuded fare antral oositlerini izole etmek için, foliküler büyümeyi uyarmak için hamile kısrak serumu gonadotropin hormonu ile önceden enjekte edilmiş anestezi uygulanmış bir dişi fare ile başlayın. Fareyi hazırlayın ve alt karın bölgesini kesin.
V şeklindeki rahim tüplerinin üst kısmındaki yumurtalıkları ortaya çıkarmak için bağırsağın dışını dışa doğru boşaltın. Bir yumurtalık disseke. Oositlerin canlılığını korumak için önceden dengelenmiş bir kültür ortamına aktarın. Stereomikroskop altında, antral folikülleri kendine özgü sıvı dolu boşluklarına göre tanımlayın.
Steril bir iğne kullanarak, oositleri serbest bırakmak için yumurtalığın antral foliküllerini delin. Optimum çapta bir pipet kullanarak, oositleri mekanik hasarlardan korumak için dikkatlice aspire edin. Foliküler hücreleri ve diğer doku kalıntılarını aspire etmekten kaçının.
Daha sonra, oositleri mineral yağ ile kaplı çoklu ortam damlalarına aktarın. Bu adım, çevredeki somatik hücrelerin çıkarılmasına ve soyulmuş oositlerin üretilmesine yardımcı olur. Son olarak, soyulmuş oositleri mineral yağ ile taze ortam damlalarına aktarın ve daha sonraki deneyler için saklayın.
Yumurtalıkları toplamak için, 3 ila 6 haftalık dişi farelere 2.5 uluslararası hamile kısrak serumu gonadotropin enjekte ederek başlayın. İki gün sonra, hasattan yaklaşık bir saat önce, bir steril Petri kabını M2 ortamı ile doldurun ve her damlayı 1,5 mililitre mineral yağ ile kaplayan ikinci bir Petri kabına birkaç 20 mikrolitrelik damla M2 ortamı ekleyin.
Ardından, ortamın dengelenmesini sağlamak için tüm Petri kaplarını 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit inkübatörüne aktarın. Daha sonra, karın duvarını kaplayan deride bir kesi yapmak için steril diseksiyon makası kullanın, ardından ilk hormon enjekte edilen farenin peritonunda bir kesi yapın.
Mesaneden başlayarak V şeklinde bir form oluşturan uterus tüplerini lokalize etmek için bağırsakları bir kenara çekmek için steril cımbız kullanın. Yumurtalıkları böbreklerin altına yerleştirdikten sonra, bir rahim tüpünü kavrayın ve dokunun dibinde küçük bir kesi ile karşılık gelen yumurtalığı serbest bırakın.
Diğer yumurtalığı hasat etmek için işlemi tekrarlayın ve ardından her iki yumurtalığı önceden dengelenmiş M2 ortamı ile doldurulmuş Petri kabına yerleştirin. Antral oositi izole etmeden önce, bir cam Pasteur pipetinin her iki ucunu kavrayarak ve pipeti bir Bunsen brülör alevi üzerinde yatay olarak tutarak cam ağızlı pipetler yapın.
Cam erimeye başladığında, pipeti alevden çıkarın ve cihazı hızlı bir şekilde ayırın. Ucu kısaltmak ve yaklaşık 100 mikronluk bir iç kılcal çap elde etmek için bir tırnak kullanarak pipetin dar noktasına yakın fazla camı sıkıca kesin.
Doğru pipet çapına sahip olmak önemlidir; çok darsa, oositler sıkışır, parçalanır ve ölür.
Ardından, pipetin değiştirilmemiş ucunu bir aspiratör tüpüne bağlayın. Daha sonra, yumurtalıkları 1 mililitre önceden dengelenmiş M2 ortamı içeren Petri kabına aktarın ve yumurtalıkların antral foliküllerini nazikçe delmek için steril bir insülin şırınga iğnesi kullanın.
Oositler serbest bırakılırken, herhangi bir folikül hücresi veya diğer doku kalıntılarını aspire etmemeye dikkat ederek bunları ağız pipetiyle nazikçe toplayın. Ardından, oositlerin zona pellucida'sına bağlı tüm kümülüs hücrelerini çıkarmak için her bir oositi önceden dengelenmiş birden fazla M2 orta damlasından hızlı bir şekilde pipetleyin. Oositler soyulduktan sonra, oositleri taze dengelenmiş M2 ortamının tek tek damlalarının dibine dikkatlice yerleştirin.