JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyoloji
0 görüntülenme • 3:53 dk. • July 8th, 2025
Sırtüstü pozisyonda ötenazi yapılmış bir fare ile başlayın. Arka ayağını sterilize edin. Altta yatan arka bacak kaslarını ortaya çıkarmak için cildi ve fasyayı (derinin altındaki ince bir bağ dokusu kılıfı) cerrahi olarak çıkarın.
Tibianın lateral tarafındaki tibialis anterior veya TA kasını bulun. TA distal tendonunu tutarak, kası alttaki dokudan ayırın. TA kasını çıkarmak için kasları dize yakın kesin ve arka ayağın ön bölmesinde bulunan altta yatan ekstansör digitorum longus veya EDL kasını ortaya çıkarın.
Distal EDL tendonunu kesin ve EDL kasını dize doğru çekin. EDL kasını çıkarmak için proksimal EDL tendonunu kesin. Hasat edilen kası, kollajenaz enzimleri içeren önceden ısıtılmış bir besiyeri olan bir tüpe aktarın ve uygun süre boyunca inkübe edin. Kollajenazlar, kas içindeki her bir kas lifini veya miyolifi çevreleyen bağ dokusunu parçalar. Bu sindirim adımı, kasın iç tabakasındaki miyolifleri gevşetir.
İnkübasyonun ardından, miyoliflerin hayatta kalma oranını artırmak için sindirilmiş kası önceden ısıtılmış ortam içeren çok kuyulu bir plakaya dikkatlice aktarın. Plakayı bir stereo mikroskobun ısıtılmış aşamasına aktarın. Şimdi, tek tek miyolifleri çözeltiye ayırmak ve serbest bırakmak için sindirilmiş kası nazikçe ezin.
İzole EDL miyofiberler, daha fazla aşağı akış analizi için kullanılabilir.
Tüm ekipmanı ve farenin arka bacaklarını% 70 etanol ile püskürtün. Cildi çıkarmak ve alttaki kasları ortaya çıkarmak için sertleştirilmiş ince kavisli makas ve ince forseps kullanın. Altta yatan kaslara zarar vermeden ince kavisli forseps ile çevredeki fasyayı çıkarın.
Tibialis anterior veya TA'yı çıkarmak için, distal TA tendonunu forseps ile tutun ve ince bir makasla kesin. TA'yı tendonda tutarken, dizinize doğru çekin ve EDL kasını ortaya çıkarmak için kası dize yakın kesin.
Distal EDL tendonunu kavisli forsepslerle kaldırın ve ince Vannas yaylı makasla kesin. EDL'yi dikkatlice dizinize doğru çekerek proksimal EDL tendonunu ortaya çıkarın. Ardından proksimal tendonu makasla kesin. Reaksiyon tüpündeki EDL kaslarını sirkülasyonlu bir su banyosunda 37 santigrat derecede inkübe edin. Kaslar gevşediğinde ve tek miyolifler göründüğünde sindirimi durdurun.
Bir ısıtma plakası ile donatılmış bir stereo binoküler mikroskop altında çalışarak, büyük delikli pipeti kullanarak kasları sıcak izolasyon ortamı ile yıkayın. İstenilen sayıda miyofiber çözelti içinde serbestçe yüzene kadar kasları büyük delikli pipetle ayırın.