Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon
15 Ağustos 2011
Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.
Bu prosedürün genel amacı, embriyonik fare merkezi sinir sisteminde, istenen gelişimsel zaman noktasında ve beynin belirlenen bölgesinde etkili gen transfeksiyonu gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle rahim hasarını önlemek için hassas kılcalların ve iğne tipi elektrotların hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hedeflenen DNA enjeksiyonu için küçük embriyoları görselleştirmek amacıyla fiber optik bir ışık kablosu kullanılarak embriyoların tutulmasına yönelik benzersiz bir yöntemi öğrenmektir.
Prosedürün üçüncü adımı, DNA'yı beynin yüzeyel kısımlarına transfekte etmek için uterus yüzeyinde çubuk tipi elektrotlarla elektroporasyon gerçekleştirmektir; prosedürün son adımı ise talamus ve hipotalamus gibi beynin daha derin yapılarına iğne tipi elektrotlarla elektroporasyon uygulamaktır. Nihayetinde, kortikal tabaka spesifik transfeksiyonu veya talamusta etkili transfeksiyonu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin standart intrauterin enjeksiyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, uterustaki embriyoların enjeksiyon bölgesinin daha iyi görünürlüğünü ve kontrolünü sağlamasıdır.
E 9.5 aşamasından itibaren embriyoları görselleştirmeyi mümkün kılan fiber optik benzeri bir kablo ve plazmid DNA'yı talamus ve hipotalamus gibi beynin daha derin bölgelerine iletmek için iğne hipozları kullanıyoruz. Bu yöntem, nöronal farklılaşma, beyin örüntülenmesi ve nöral bağlantısallık gibi gelişmekte olan beyne dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, iğneyi ve elektrodu şekillendirmenin ve kolektif konumlama yapmanın zorluğu nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.
Uterus ve embriyolar. Bu yöntemin görsel gösterimi, hassas iğne elektrotlarının nasıl hazırlanacağını ve embriyoların elektroporasyon için nasıl konumlandırılacağını görmek açısından kritiktir. Çünkü bu iki adım, başarılı sonuçlar için temel teşkil etmektedir. Kılcal tüpleri hazırlamak için üretici talimatlarına uygun olarak bir mikropipet çekicisi kullanın.
Bu prosedürde, iç lifi olmayan bir milimetrelik cam kapiler tüpler kullanıyoruz. Çekilmiş iğnelerin uçtan itibaren 800 mikrometre ile bir milimetre arasında ölçülmesi gerekir; bir diseksiyon mikroskobu kullanarak dış çapı 60 mikrometreden düşük olan iğne uçlarını, 20 ila 30 mikrometre çap olacak şekilde pensle kesin. Her bir iğneyi mikrometre ile ölçün.
Ardından, sarma yöntemiyle mikro elektrotları hazırlayın. Tungsten telin bir ucunu altın kaplama bir pine sarın. Negatif elektrotlar için tungsten tel, pozitif elektrotlar için ise platin tel kullanın.
Teli, param ile pine sabitleyin. Ardından teli bir pamuklu çubuğun plastik sapına yerleştirin ve her iki ucunu phim ile eşit şekilde sarın; telin ucunu, uç kısmında 20 ila 30 micrometers ve uçtan 800 micrometers ile bir millimeter arasındaki bölgede 60 micrometers genişliğe ulaşana kadar ince zımpara ile düzgünce sivriltin. Son boyutları tekrar bir mikrometre ile kontrol edin.
Ardından, izolasyon sağlamak amacıyla telin tamamına ince bir katman uygulamak için sivrilmiş teli bir damla oje içerisine daldırın. Oje kuruduktan sonra, uç kısmındaki son 200 micrometers'lık alanı temizlemek için asetona batırılmış bir pamuklu çubuk kullanın. Platin elektrotlar hazır olarak satın alınır ve herhangi bir hazırlık gerektirmez.
Bu prosedürde, CUY six 10 P four dash one nepo gen elektrodu kullanıyoruz. Plazma DNA'sını bir maxi prep veya eşdeğer bir yöntemle saflaştırın, 100 µg DNA'yı yeni bir tüpe aktarın ve 10 µL %1'lik fast green boyası ekleyin. Nihai 1 µg/µL plazma DNA konsantrasyonu için hacmi TE ile 100 µL'ye tamamlayın. Çözeltiyi pipetleme yoluyla nazikçe karıştırın, ardından safsızlıkları ve tuzları gidermek için DNA çözeltisini oda sıcaklığında 14.000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.
SNAT'yi yeni bir tüpe aktarın. DNA çözeltisi, tüm prosedür boyunca tüp içinde oda sıcaklığında tutulabilir. Ardından, üretici talimatlarına uygun olarak çekilmiş bir iğneyi mikro manipülatöre bağlayın ve iğneyi doldurmak için iğne ucunu DNA çözeltisine daldırın.
Mikromanipülatörü dikkatlice kenara alın ve ameliyat öncesi hazırlıkları yapın. Vücut ağırlığını belirlemek için embriyonik gün 9,5 ile 15,5 arasındaki gebe bir fareyi tartın.
Ardından intraperitoneal olarak, vücut ağırlığının gram başına 50 mikrogram olacak şekilde farmasötik kalite sodyum pentobarbital enjekte edin ve beş dakika bekleyin. Sodyum pentobarbital alternatifi olarak ketamin, ksilazin enjeksiyonu veya gaz anestezikleri kullanılabilir.
Anestezi sonrası, karın bölgesindeki tüyleri tıraş etmek için bir jilet ve %50 etanol kullanın. Cildi, Betadine ve %70 alkol ile sırayla ovarak temizleyin. İnce makasla abdominal orta hatta bir insizyon yapın.
Tüm uterus kornularını dikkatlice, 1x fosfat tamponlu tuzlu su veya PBS ile nemlendirilmiş ve yaranın etrafına yerleştirilmiş pamuklu gazlı bez üzerine çıkarın. Uterusu sürekli olarak PBS ile nemli tutun. Esnek bir optik fiber kablo kullanarak.
Kabloyu uterus kornusunun altına yerleştirin. Uterusu, optik fiber ışığı ile başparmağınız arasında konumlandırın ve embriyoyu uterus duvarına daha yakın olacak şekilde yukarı itmek için hafifçe sıkın. Embriyo, başı solda ve yukarı bakacak şekilde konumlandığında, cam kapilerle dikkatlice hedef ventriküle girin ve embriyonik 13.5. günde kortikal tabaka dördün elektroporasyonu için yaklaşık bir mikrolitre DNA solüsyonu enjekte edin.
Çubuk platin elektrotları uterusun dışına yerleştirin ve 38 volt değerinde 50 milisaniye boyunca beş kez kare dalga akım darbeleri uygulayın. Embriyonik gün 10,5'te talamus veya hipotalamusa ulaşmak için mikro elektroporasyon kullanılıyorsa, ince tungsten negatif elektrodu DNA enjekte edilen ventriküle, platin pozitif elektrodu ise uterusa yerleştirin. Hedef bölgeyi her iki elektrodun uçları arasına konumlandırın ve önerilen kare dalga akım darbelerini yedi volt değerinde 100 milisaniye boyunca üç kez uygulayın.
Elektroporasyon tamamlandıktan sonra, uterus kornusunu orijinal konumuna geri getirin ve 500 µL PBS ekleyin. İnsizyonun iç katmanını cerrahi bir sutur ile dikin. Ardından dış katmanı dokuz milimetrelik bir otomatik klips ile kapatın.
Farenin cerrahi işlemden ve anesteziden etkilerini atlatması için iki saat boyunca ısıtıcı ped üzerinde bekletin. Burada, embriyonik 13,5, 14,5 ve 15,5 günlerinde uygulanan kortikal bölge platin elektroporasyonu görülmektedir. Beyinler postnatal dönemde hasat edilmiştir.
Altıncı gün. Elektroporasyon yapılan kortikal hücre tabakası her deneyde belirgin şekilde farklıdır. Bu durum, zamana bağlı elektroporasyonun, kortikal tabakalara özgü fonksiyon kazanımı ve fonksiyon kaybının mümkün olduğunu göstermektedir.
Burada gösterildiği gibi, talamus ve hipotalamus gibi derin dokulara elektroporasyon uygulanışı. Çubuk platin elektrotlar kullanmak genellikle düşük verimlilik sağlar; elektroporasyon için mikro elektrotlar kullanmak, bu derin dokularda daha iyi verimlilik ve canlılık sunar.
Plazmid DNA çözeltisini fare embriyolarının üçüncü ventrikülüne enjekte ettik. Embriyonik 11,5. günde, iğne elektroporasyonuyla sadece talamusa uygulama yaptık; talamus eksonlarının çoğu postnatal altıncı güne kadar kortekse projeksiyon yapar. Burada, gelişmekte olan sefalona P-C-A-G-E-Y-F-P mikro elektroporasyonu uygulamasını gösteriyoruz.
Talamus bölgesi, tüm talamik post-mitotik nöronları işaretleyen RORC ile gösterilmiştir. Korteksin dördüncü tabakasına doğru beyaz oklarla gösterilen akson projeksiyonları, aynı zamanda tüm nöronu dolduran EYFP ile de görselleştirilebilir. Korteksteki dördüncü tabakanın konumu da RORC antikoru ile işaretlenmiştir.
MA başladığında, bu teknik doğru şekilde uygulandığında litre başına 15 dakikada tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, işlem sonrası herhangi bir hasarı önlemek için test tüpünü çok dikkatli tutmanız gerektiğini unutmamak önemlidir. Hücre spesifikasyonunun gelişiminden sonraki moleküler mekanizmayı anlamak için, MDNA'ya spesifik bir kromofor eklemek gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.
Bu teknik, merkezi sinir sistemi gelişim alanıyla ilgilenen araştırmacıların; örüntü oluşumu, aksonal büyüme ve devre oluşumundaki moleküler mekanizmaları keşfetmelerine olanak sağlar.
Genel Bakış
Bu makale, özgün bir cerrahi teknik ve özelleştirilmiş elektrotlar kullanılarak gelişmekte olan fare beynine gen aktarımı yöntemini açıklamaktadır. Bu yaklaşım, plazmid DNA'nın hassas bir şekilde transfeksiyonuna olanak tanıyarak beyin gelişimi üzerine yapılan araştırmaları kolaylaştırmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gen Transfer Teknikleri
- Embriyonik Gelişim
Arka Plan
- Bu prosedür, embriyonik fare merkezi sinir sisteminde verimli gen transfeksiyonu sağlamayı amaçlamaktadır.
- Uterin hasarı en aza indirmek için hassas kapilerler ve iğne tipi elektrotlar kullanılır.
- Fiber optik görüntüleme kullanılarak embriyolar için özgün bir tutma yöntemi içerir.
- Hedeflenen beyin bölgelerine DNA transfekt etmek için elektroporasyon uygulanır.
Çalışmanın Amacı
- Belirli gelişim aşamalarında hedeflenmiş gen transfeksiyonu gerçekleştirmek.
- Enjeksiyon işlemi sırasında görünürlüğü ve kontrolü artırmak.
- Nöronal farklılaşma ve beyin bağlantısallığına ilişkin temel soruları araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- DNA enjeksiyonu için hassas kapilerlerin ve elektrotların hazırlanması.
- Embriyo görüntüleme için fiber optik kabloların kullanımı.
- Çeşitli beyin bölgelerine DNA transfeksiyonu için elektroporasyon teknikleri.
- Embriyo yönetimi ve DNA iletimi için detaylı cerrahi prosedürler.
Ana Sonuçlar
- Kortikal katmanlarda ve daha derin beyin yapılarında başarılı transfeksiyon gözlemlendi.
- Geleneksel yöntemlere kıyasla transfeksiyon bölgesi üzerinde daha fazla kontrol sağlandığı kanıtlandı.
- Sonuçlar, beyin gelişim süreçlerinin anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
Sonuçlar
- Bu yöntem, embriyonik farelerde gen transfeksiyonu için güvenilir bir yaklaşım sunmaktadır.
- Nörobilimsel araştırmalar için görünürlük ve hassasiyet açısından önemli avantajlar sağlamaktadır.
- Gelecekteki çalışmalar, beyin gelişiminin çeşitli yönlerini incelemek için bu tekniği kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Utero elektroporasyon, gelişmekte olan beyindeki aday genlerin erken evre fonksiyonel incelemesine olanak tanıyarak, transgenik model oluşturulması öncesinde hedef doğrulamayı destekler. Bu yaklaşım, CRE hatlarına olan bağımlılığı azaltır, talamus ve hipotalamus gibi bölgelere erişilebilirliği genişletir ve nörogelişimsel hedef keşfinde mekanistik risklerin azaltılmasını hızlandırır. Uzamsal ve zamansal olarak kontrollü transfeksiyon sağlayarak, erken hedef hipotez testlerinde öngörüsel güveni artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Terapötik hipotezleri netleştirmek amacıyla, belirli embriyonik beyin bölgelerindeki sinyalizasyon ve akson kılavuzlama genlerinin fonksiyonel testlerini mümkün kılar.
- Operasyonel Değer: Erken hedef sorgulamaları için CRE bağımlı knock-in/knock-out modellerine hızlı ve maliyet etkin bir alternatif sunar.
- Öngörücü Değer: Bölgeye özgü CRE hatlarının bulunmadığı alanlarda fonksiyon kazanım ve kaybı çalışmalarını destekleyerek hedef güvenini artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Fenotip tabanlı tarama için kortikal katmanlarda ve derin beyin yapılarında nicel olarak değerlendirilebilir transfeksiyon modelleri oluşturur.
- Operasyonel Değer: Deneyler arası tekrarlanabilirliği artırmak için standartlaştırılmış elektrot hazırlama ve DNA iletimi yöntemlerini kullanır.
- Ölçeklenebilirlik: Tutarlı embriyo işlemleri için fiber optik görüntüleme ve kapiler tabanlı uterus erişiminin tekrarlı kullanımına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Erken embriyogenezden postnatal analize kadar nöronal farklılaşma, beyin desenlemesi ve nöral bağlantıların incelenmesini kolaylaştırır.
- Mekanistik Risk Azaltma: Nörogelişimsel bozukluk modelleriyle ilişkili olan talamus ve hipotalamus gibi derin beyin yapılarındaki gen fonksiyonlarının araştırılmasına olanak tanır.
- Öngörü Güveni: Zamana bağlı elektroporasyon, tabaka spesifik transfeksiyona imkan tanıyarak doz ve zamanlama yanıt modellemesini destekler.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, embriyonik beyin bölgelerinde hipotez odaklı gen modülasyonuna olanak tanıyarak, öncü bileşik tanımlama ve preklinik model seçimine veri sağlayarak erken keşif iş akışlarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Ventriküler bölgelerde ve derin beyin yapılarında aday genlerin hedeflenmiş transfeksiyonu yoluyla yolak açıklığa kavuşturulmasını ve biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Tarama: Fenotipik taramalarda karşılaştırmalı durum analizini destekleyen kantitatif, mekansal olarak çözünür transfeksiyon çıktıları sağlar.
- Analitik: Floresan raporlar ve immünboyama yoluyla transfeksiyon verimliliğinin ve kortikal tabaka özgüllüğünün ölçülmesine olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Erken embriyonik gen fonksiyonunu, postnatal beyin örüntüleme ve bağlantısallık sonuçlarıyla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hedef gen ve gelişimsel zaman noktası için embriyonik beyin transfeksiyonuna yönelik standartlaştırılmış, yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hassas spatiotemporal gen modülasyonu aracılığıyla, erken nörogelişimsel hedef doğrulamasındaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış kapiler ve elektrot hazırlığı, fiber optik görselleştirme ve kontrollü elektroporasyon parametreleri yoluyla tekrarlanabilirliği artırır.
- Stratejik Değer: Hedeflerin erken fonksiyonel değerlendirmesine olanak tanıyarak go/no-go (devam/dur) kararlarını iyileştirir ve yetersiz doğrulanmış adaylara yapılan yatırımı azaltır.
- Portföy Etkisi: Kaynak yoğun model oluşturma aşamasından önce, hastalıkla ilgili embriyonik sistemlerde fonksiyonel veriler üreterek riskle uyumlu önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Mikrocerrahi, embriyo manipülasyonu ve tungsten/platin teller ile kapiler çekiciler kullanılarak elektrot üretimi konularında uzmanlık gerektirir.
- Fiber optik ışık kabloları, mikromanipülatörler ve hassas voltaj ile pals kontrolü yapabilen elektroporatörler dahil olmak üzere özel enstrümantasyona bağlıdır.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için kullanıcılar ve laboratuvarlar arasında embriyo konumlandırması, DNA konsantrasyonu ve elektroporasyon parametrelerinin standardize edilmesini gerektirir.
- Farklı embriyonik evreler (E9.5–E15.5) ve beyin hedefleri (kortikal yapılara karşı talamus/hipotalamus gibi derin yapılar) için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Protokolde belirtildiği üzere, iğne elektrotların şekillendirilmesindeki teknik zorluklar ve prosedürler sırasında uterus bütünlüğünün korunması gibi pratik kısıtlamalar mevcuttur.
