Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik fare merkezi sinir sisteminin istenen gelişimsel zaman noktasında ve beyin bölgesinde verimli gen transfeksiyonu sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle rahim hasarını önlemek için hassas kılcal damarlar ve iğne tipi elektrotlar hazırlanarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hedeflenmiş DNA enjeksiyonu için küçük embriyoları görselleştirmek amacıyla fiber optik ışık kablosu kullanılarak uygulanan benzersiz bir embriyo tutma yöntemini öğrenmektir.

Prosedürün üçüncü adımı, DNA'yı beynin yüzeysel kısımlarına transfekte etmek amacıyla uterus yüzeyine çubuk tipi elektrotlarla elektroporasyon uygulamaktır; prosedürün son adımı ise talamus ve hipotalamus gibi beynin daha derin yapılarına iğne tipi elektrotlarla elektroporasyon gerçekleştirmektir. Nihayetinde, kortikal tabaka özel transfeksiyonu veya talamusta etkili transfeksiyon olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin, standart intrauterin enjeksiyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, uterustaki embriyoların enjeksiyon bölgesinde daha fazla görünürlük ve kontrol sağlamasıdır.

E 9.5'ten itibaren embriyoları görselleştirmeyi mümkün kılan fiber optik benzeri bir kablo ve plazmit DNA'yı talamus ve hipotalamus gibi beynin daha derin bölgelerine iletmek için iğne hipozları kullanıyoruz. Bu yöntem; nöronal farklılaşma, beyin örüntülenmesi ve nöral bağlantısallık gibi gelişmekte olan beyne dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler; iğneyi ve elektrotu şekillendirmek ve doğru konumu belirlemek zor olduğu için başlangıçta zorlanacaklardır.

Uterus ve embriyolar. Bu yöntemin görsel gösterimi, hassas iğne elektrotların nasıl hazırlanacağını ve embriyoların elektroporasyon için nasıl konumlandırılacağını görmek açısından kritiktir; zira bu iki adım, başarılı sonuçlar elde etmek için temel teşkil eder. Kapillerleri hazırlamak için, üretici talimatlarına uygun olarak bir mikropipet çekici kullanın.

Bu prosedürde, iç fiberi olmayan bir milimetrelik cam kılcal tüpler kullanıyoruz. Çekilmiş iğnelerin, bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak uçtan itibaren 800 mikrometre ile bir milimetre arasında ölçülmesi ve dış çapının 60 mikrometreden küçük olması gerekir; iğne uçları forseps ile 20 ila 30 mikrometre çapına kadar kesilir. Her bir iğneyi bir mikrometre kullanarak ölçün.

Ardından, sarma yöntemiyle mikro elektrotları hazırlayın. Tungsten telin bir ucunu altın kaplama bir pime sarın. Negatif elektrotlar için tungsten tel, pozitif elektrotlar için ise platin tel kullanın.

Teli param ile pine sabitleyin. Ardından teli bir pamuklu çubuğun plastik gövdesine yerleştirin ve her iki ucunu phim ile eşit şekilde sarın; telin ucunu, uç kısmı 20 ila 30 µm ve uçtan 800 µm ile 1 mm arasındaki mesafe 60 µm olana kadar ince zımpara ile düzgünce sivriltin. Son boyutları tekrar bir mikrometre ile kontrol edin.

Ardından, yalıtım sağlamak amacıyla tüm tel üzerine ince bir tabaka uygulamak için sivriltilmiş teli bir damla oje içerisine daldırın. Oje kuruduktan sonra, uç kısmın son 200 micrometers bölümündeki ojeyi temizlemek için asetonlu bir pamuklu çubuk kullanın. Platin elektrotlar hazır olarak satın alınır ve herhangi bir hazırlık gerektirmez.

Bu prosedürde, CUY six 10 P four dash one nepo gen elektrodu kullanıyoruz. Plazma DNA'sını bir maxi prep veya eşdeğer bir yöntemle saflaştırın, 100 µg DNA'yı yeni bir tüpe aktarın ve 10 µL %1'lik fast green boyası ekleyin. Nihai 1 µg/µL plazma DNA konsantrasyonu için hacmi TE ile 100 µL'ye tamamlayın. Çözeltiyi pipetleme yoluyla nazikçe karıştırın, ardından safsızlıkları ve tuzları uzaklaştırmak için DNA çözeltisini oda sıcaklığında 14.000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

SNAT'ı yeni bir tüpe aktarın. DNA çözeltisi, tüm prosedür boyunca tüp içerisinde oda sıcaklığında tutulabilir. Ardından, çekilmiş bir iğneyi üretici talimatlarına göre bir mikromanipülatöre bağlayın ve iğneyi doldurmak için ucunu DNA çözeltisine daldırın.

Mikromanipülatörü dikkatlice kenara alın ve cerrahi işlem öncesinde hazırlıklarınızı yapın. Vücut ağırlığını belirlemek için embriyonik gün 9,5 ile 15,5 arasındaki gebe bir fareyi tartın.

Ardından intraperitoneal olarak, vücut ağırlığının gramı başına 50 micrograms sodyum pentobarbital enjekte edin ve beş dakika bekleyin. Sodyum pentobarbital yerine ketamin, ksilazin enjeksiyonu veya gaz anestezikleri kullanılabilir.

Anestezinin ardından, karın bölgesindeki tüyleri temizlemek için bir jilet ve %50 etanol kullanın. Cildi, Betadine ve %70 alkol ile dönüşümlü ovmalar yaparak hazırlayın. İnce makasla abdominal orta hat boyunca bir insizyon yapın.

Tüm uterus kornularını, yaranın etrafına yerleştirilmiş fosfat tamponlu salin (PBS) ile nemlendirilmiş pamuklu gazlı bez üzerine dikkatlice çıkarın. Uterusu sürekli olarak PBS ile nemli tutun. Esnek bir optik fiber kablo kullanarak.

Kabloyu uterus kornusunun altına yerleştirin. Uterusu, optik fiber ışık ile başparmak arasına konumlandırın ve embriyoyu uterus duvarına daha yakın bir konuma itmek için nazikçe sıkın. Embriyo, başı sola bakacak ve yukarı dönük olacak şekilde konumlandırıldığında, cam kılcal boruyu hedef ventriküle dikkatlice yerleştirin ve embriyonik 13.5. günde kortikal katman dörtün elektroporasyonu için yaklaşık bir mikrolitre DNA çözeltisi enjekte edin.

Çubuk platin elektrotları uterusun dışına yerleştirin ve 38 voltluk gerilimi 50 milisaniye boyunca beş kez kare dalga akım darbeleri şeklinde uygulayın. Embriyonik gün 10,5'te talamus veya hipotalamusa ulaşmak için mikro elektroporasyon kullanılıyorsa, ince tungsten negatif elektrodu DNA enjekte edilen ventriküle, platin pozitif elektrodu ise uterusa yerleştirin. Hedef bölgeyi her iki elektrodun uçları arasına konumlandırın ve önerilen kare dalga akım darbelerini yedi voltluk gerilimle 100 milisaniye boyunca üç kez uygulayın.

Elektroporasyon tamamlandıktan sonra, uterus kornusunu orijinal konumuna geri getirin ve 500 µL PBS ekleyin. İnsizyonun iç tabakasını cerrahi sütur ile dikin. Ardından, dış tabakayı dokuz milimetrelik bir oto klips ile kapatın.

Fareyi, cerrahi işlemden ve anestezinin etkisinden kurtulması için iki saat boyunca ısıtıcı bir pedin üzerine yerleştirin. Kortikal bölgenin platin elektroporasyonu burada embriyonik gün 13,5, 14,5 ve 15,5'te uygulanmış olarak görülmektedir. Beyinler postnatal dönemde hasat edilmiştir.

Altıncı gün. Elektroporasyon uygulanan kortikal hücre tabakası her deneyde belirgin şekilde farklılık göstermektedir. Bu durum, zamana bağlı elektroporasyonun, kortikal tabakalara özgü fonksiyon kazanımı ve fonksiyon kaybını mümkün kıldığını göstermektedir.

Burada gösterildiği gibi, talamus ve hipotalamus gibi derin dokulara elektroporasyon uygulanışı. Çubuk şeklinde platin elektrotlar kullanmak genellikle düşük verimlilik sağladığından, elektroporasyon için mikro elektrotlar kullanılır. Bu derin dokular daha iyi verimlilik ve viabilite sunar.

Plazmid DNA çözeltisini fare embriyolarının üçüncü ventrikülüne enjekte ettik. Embriyonik 11,5. günde, sadece talamusla sınırlı iğne elektroporasyonu uyguladık; talamusun çoğundaki eksonlar postnatal altıncı güne kadar kortekse projeksiyon yapar. Burada, gelişmekte olan sefalona P-C-A-G-E-Y-F-P mikro elektroporasyonunu gösteriyoruz.

Talamus bölgesi, tüm talamik post-mitotik nöronları işaretleyen RORC ile gösterilmiştir. Korteksin dördüncü tabakasına giden ve beyaz oklarla gösterilen akson projeksiyonları, tüm nöronu dolduran EYFP ile de görselleştirilebilir. Korteksteki dördüncü tabakanın konumu da RORC antikoru ile işaretlenmiştir.

MA başladıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulandığında litre başına 15 dakikada tamamlanabilir. Bu prosedür gerçekleştirilirken, işlem sonrası herhangi bir hasarı önlemek için test tüpünün çok dikkatli tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Hücre spesifikasyonunun gelişiminden sonraki moleküler mekanizmayı anlamak için MDNA'ya spesifik bir kromofor dahil etmek gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu teknik, merkezi sinir sistemi gelişimi alanındaki araştırmacıların desen oluşumu, aksonal büyüme ve devre oluşumundaki moleküler mekanizmaları keşfetmelerine olanak tanır.