Name: Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-15T15:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Öğrenin fare embriyonik merkezi sinir sisteminde hassas gen transfeksiyonu için uterus içi elektroporasyon yöntemini. Fiber optik görüntüleme ve özel iğne elektrotları ile korteks ve talamus gibi derin beyin yapılarına kontrollü DNA aktarımı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma RIKEN Beyin Bilimi Enstitüsü (BSI), İnsan Frontier Bilim Programı (HFSP) (TS verilen) ve RIKEN Junior Araştırma İşbirliği Programı (JRA), MK verilen RIKEN Beyin Bilimi Enstitüsü (BSI), İnsan Frontier Lisans Programı tarafından finanse edildi (HFSP) (TS ödüllendirildi) ve RIKEN Seyirci Araştırma İşbirliği Programı (JRA, MK verilen) bu işi finanse.

1. Kapiller ve DNA çözüm enjeksiyon için hazırlanması <ol><li> Maxi-Hazırlık veya dengi yöntemi plazmid DNA arındırın ve 2-3 mg / ml bir final konsantrasyon. Kısım 100 mikrogram, DNA hızlı yeşil boya (% 1 hisse senedi) ve TE 10μl (10mM Tris Üssü, 1mm EDTA Çözüm, pH 8.0) ve enjeksiyon karışımı için son DNA konsantrasyonu 1μg / ul 100 ses seviyesini ayarlamak ul. Plazmid DNA konsantrasyonu değiştirilebilir tek tek test edilmesi gerekir transfeksiyon verimliliği, plazmid boyutu bağlıdır ve. </li><li> 14.000 RPM hızında oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DNA çözüm Spin ve herhangi bir kalıntı kaldırmak için supernatant toplamak. </li><li> Mikropipet çektirmenin kullanarak bir cam kapiller tubea cam kapiller tüplerin çekin. Ucu 20-30 mikron çapında yapmak için forseps ile ucu kapalı Pinch. Ucundan 800 mm-1 mm ölçün ve dış çapı 60 mikron (Şekil 1A) daha az olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Mikromanipülatör kılcal bağlayın ve madeni yağ ile doldurun. DNA çözüm, çözüm içine daldırın ucu kapiller doldurmak ve DNA çözüm emmek için. </li></ol> 2. Platin elektrot Kaynaş Burada beyin korteks (Şekil 1F) gibi yüzeysel bölge içine electroporate sopa platin elektrotlar (Nepe gen, CUY611P2-1) kullanılır. 3. Mikro elektrotlar hazırlanması Beyin (yani, talamus ve hipotalamus) (Şekil 2B-E) derin bölüme electroporated için mikro elektrotlar kullanın. <ol><li> Bir tungsten sonunda (negatif elektrot) ve platin (pozitif elektrot) teller, altın kaplama pinler sarılmış ve parafilm ile sabittir. Bir pamuklu çubukla kök tel takın ve parafilm (Şekil 1B) ile her iki ucunda sarın. </li><li> 20-30 mikron 800 dış çapı 60 mikron mikron 1 mm ucu (Şekil 1C ve D) ulaşıncaya kadar eşit bir şekilde zımpara kağıdı ile telin ucu keskinleştirmek. </li><li> Yalıtımı için tel oje ince bir kat uygulayın. Oje kuruduktan sonra, ucu (uç kısmından yaklaşık 200 mikron) çıkarmak için aseton batırılmış bir pamuklu bir bez kullanın. Önemli not: farenin rahmine zarar görmesini önlemek için, 800 içinde kısmı mm-1 mm uç çapı 70 mm daha fazla (Şekil 1E) olmalıdır. </li></ol> 4. Ameliyat hazırlanması <ol><li> Hamile bir fare (E9.5-E15.5) anestezisi. Biz ilaç sınıf sodyum pentobarbital anesthetization göstermektedir (Tablo II; gram vücut ağırlığı başına 50 mikrogram, intraperitoneal olarak enjekte edilir ve 5 dakika bekleyin). Bir anestezik olarak pentobarbital sodyum Alternatifler Ketamin / Xylazine enjeksiyon veya gaz anestezikler (gaz kısa süreli işlemleri için tercih edilir). Enjeksiyon herhangi bir organ önlemek için dikkat ile yapılmalıdır, aksi takdirde rahmin zarar veya hayvanı öldürmek için neden olacaktır. Başarılı IP yapıldığında, hayatta kalma oranı% 95 daha fazla. Ayrıca cerrahi, açık hava ortamında yapılabilmektedir. Önce anestezik onaylamak için parmak pinching hayvan tarafından tepki olmaması için çalışma, test başladı. </li><li> Bir jilet ve% 50 EtOH kullanarak karın saç tıraş. Alternatif scrubs betadin ve alkol (% 70) ile cildi hazırlayın. </li><li> Ince makas ile karın orta hat kesi olun ve tüm rahim boynuzları 37 üzerine dikkatlice dışarı çekin ° C önceden ısıtılmış fosfat tamponlu salin (PBS) nemlendirilmiş pamuk gazlı bez, yara etrafına yerleştirilir. PBS zaman rahim nemli tutun. </li><li> Parmağı ve orta parmak arasında esnek bir fiber optik kablo tutun ve uterin boynuz altına koyun. Kullanmadan önce% 70 EtOH ile temizleyin kablo. Hiçbir mikroskop ya da büyüteç görünüm için gereklidir. Pozisyon fiber optik ışık optik kablo ve başparmak arasında rahim ve rahim duvarına yakın embriyo yukarı itmek için yavaşça sıkın. </li></ol> 5. DNA ve elektroporasyon Enjeksiyon <ol><li> Embriyo yerleştirilmiş, cam hedef ventrikül içine dikkatlice kılcal ve yaklaşık 1 ul DNA çözüm (Şekil 2A) enjekte yerleştirin. </li><li> Electoporation için sopa platin elektrotları ile brainIf yüzeysel bir parçası elektroporasyon için rahim dışında elektrotlar ve üreticinin talimatlarına göre (Tablo I) önerilen kare dalga akım darbeleri uygulayın. Beynin derin kısmında usingFor elektroporasyon, nmicro elektroporasyon, eedle tipi elektrotlar iseniz. Iinsert DNA'sına ince bir tungsten negatif elektrot önerilen kare dalga akım darbeleri (Tablo I) (Şekil 2B) uygulamak sonra, iki elektrot arasındaki yeri ve hedef bölge rahim içine enjekte ventrikül ve platin elektrot. </li></ol> 6. Mesaj elektroporasyon <ol><li> Onun orig uterin horn yerine geriİnal konumu ve 37 ° C önceden ısıtılmış PBS 500 mcL ekleyin. </li><li> 9 mm autoclipauto klip ile cerrahi dikiş ve yakın dış tabaka ile iç tabaka dikin. </li><li> 2 saatlik bir ısıtma yastığı yerleştirin hayvanlar anestezi kurtarma izin vermek. Carprofen veya buprenorfin gibi Analjezikler, ameliyat sonrası ağrı için verilebilir. </li></ol> 7. Temsilcisi sonuçları: PCAG-EYFP kortikal elektroporasyon bazı örnekler, farklı zaman noktalarında sopa platin elektrot kullanılarak inşa şekil Şekil 32 de gösterilmiştir. Brain E13.5, E14.5, E15.5 electroporated ve postnatal gün (P) 6 hasat edilir. Ortaya çıkan ntibody boyama RORC 'ün 4. katmandaki ve EYFP transfekte hücreleri konumunu konumu GFP antikor boyama ile ortaya ortaya çıkarır ve her iki görüntüler dayatılan süper (Şekil 3A ve B) . Etiketli kortikal hücreler, zaman-bağımlı elektroporasyon kortikal tabaka özel GOF / LOF mümkün kılar (Şekil 32), her bir deney electroporated kortikal hücreler katmanı açıkça farklıdır. Hücre transfeksiyon embriyolar ve verimlilik canlılığı, embriyonun yaşına ve elektroporasyon yerini bağlı olarak değişir. Örnekler Tablo 1'de listelenmiştir, ancak, koşullar sahne ve beynin bir parçası olarak her elektroporasyon için optimize edilmiş olmalıdır. Sopa platin elektrotları ile talamus ve hipotalamus gibi derin bir doku içine Elektroporasyon genelde düşük verimlilik (Tablo 1) verir. Beynin derin bölgelerine ulaşacak whichelectrodes, mikro elektrotlar kullanarak bu sorun çözülebilir. Şekil 3, gelişmekte olan diensefalon pCAG EYFP elektroporasyon 4 gösterileri örnek. Plazmid DNA çözüm E11.5 3. ventrikül içine enjekte edilir ve mikro elektroporasyon (Şekil 3C4C) tarafından takip edilmektedir. Electroporated alan talamus sınırlıdır korteks (Şekil 3B4B) aksonlar proje. Korteks tabakası 4 Akson, projeksiyon, aynı zamanda tüm nöron fillesfills EYFP tarafından görüntülenmiştir. (Şekil 3A4A). <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Cartoon kılcal doğru şekli gösteren şematik. (A) cam kapiller tüp, belli bir şekli yapmak için bir mikropipet çektirmesi ile çekilir. Bir ucu 20-30 mikron yapmak için forseps sıkışmak kapalı. Ucu (kırmızı dirsek) 800 mm-1mm ölçün ve dış çapı 60 mikron (yeşil dirsek) daha az olduğundan emin olun. (B), tungsten veya platin tel Bir ucu altın kaplama pimlerin üzerine sarılmış ve parafilm ile sabittir. Daha sonra ucu 1 mm den 20-30 mikron dış çap ve 60 mm olmak için bahşiş yapmak için zımpara kağıdı kullanın. (C) Görüntü tungsten tel şekillendirme önce. (D), tungsten tel şekillendirme sonra Image. (E), ince bir kat oje uygulandıktan sonra tungsten tel Resim. E Ölçekli bar CE için 10 mikron (küçük ölçekli). (F) Stick platin elektrot (Nepa gen. CUY611P2-1). F Ölçekli bar, 2 mm. <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 cerrahi işlemin Karikatür şema. (A), lateral ventrikül veya büyük embriyolar (sol taraf) içine ve 3. ventrikül veya küçük embriyolar (sağ tarafı) içine enjeksiyon Diyagramı . (B) platin çubuk elektrot (sol taraf) ve iğne tipi elektrot (sağ tarafı) tarafından electrporation Diyagramı. <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 fare telencephalon geliştirilmesi E13.5 (A) E14.5 (B) ve E15.5 (C) pCAG-EYFP electroporated ve P6 hasat edildi. Brain ayrı koronal kesitli ve GFP antikor veya RORC 'ün antikor ile boyandı ve görüntüler birleştirilir. (A) E13.5 transfect birçok katman 4 nöronlar pCAG-EYFP plazmid Elektroporasyon. 4 belirteçlerinin RORC 'ün tabakası ile örtüşmektedir. Katman 4 nöronlar daha yüzeysel E14.5 transfect hücreler, (B) pCAG-EYFP plazmid Elektroporasyon. (C) E15.5 layer 2 / 3 gibi elektroporasyon etiket birçok yüzeysel nöronlar. Ölçek çubuğu 200 mm. <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 talamo-kortikal aksonlar (TCA) içine EYFP Transfeksiyon. (A) kortikal 4. katmandaki TCA terminus GFP antikor boyama ile ortaya çıkar. RORC 'ün antikor boyama, 4 katmanlı bir pozisyon ortaya çıkarmak için kullanılır. Her iki görüntü aynı bölümde alınan ve birleştirilir. (B) talamus içine elektroporasyon konumu ifade talamus 11 sınırlıdır GFP antikor boyama ve RORC 'ün boyama, aynı zamanda gösterilir. (C) talamik elektroporasyon ve TCA projeksiyon Karikatür şematik gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 200 mm.

<ol><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li>
<li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li>
<li>Imayoshi, I., Shimogori, T., Ohtsuka, T., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hes+genes+and+neurogenin+regulate+non-neural+versus+neural+fate+specification+in+the+dorsal+telencephalic+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hes genes and neurogenin regulate non-neural versus neural fate specification in the dorsal telencephalic midline.</a> Development. 135, 2531-2541 (2008).</li>
<li>Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+signaling+centers+expressing+BMP%2C+WNT+and+FGF+proteins+interact+to+pattern+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex.</a> Development. 131, 5639-5647 (2004).</li>
<li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Development Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).</li>
<li>Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Avian Embryology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTakahashi%2C+Y+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. Vol 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. 271-271 (2008).</li>
<li>Feil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-activated+site-specific+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ligand-activated site-specific recombination in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 10887-10890 (1996).</li>
<li>Indra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally-controlled+site-specific+mutagenesis+in+the+basal+layer+of+the+epidermis%3A+comparison+of+the+recombinase+activity+of+the+tamoxifen-inducible+Cre-ERT+and+Cre-ERT2+recombinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ERT and Cre-ERT2 recombinases.</a> Nucleic Acids Research. 27, 4324-4327 (1999).</li>
<li>Nakagawa, Y., O'Leary, D. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+patterned+expression+of+orphan+nuclear+receptor+genes+ROR+alpha+and+ROR+beta+in+developing+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamic patterned expression of orphan nuclear receptor genes ROR alpha and ROR beta in developing mouse forebrain.</a> Developmental Neuroscience. 25, 234-244 (2003).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol, biz sadece, farklı şeklinde elektrotlar kullanarak küçük bir embriyonik beyin kısıtlı alana pCAG EYFP transfeksiyon tekniği yararları nitelendirdi. Transfeksiyon verimlilik karşılaştırması farklı organizatörü tarafından daha önce açıklandığı için, hücre tipi özgüllüğü 1 gösterir. Ancak, sadece geçici ve plazmid bağlıdır değişir transfeksiyon gibi tekniği, sınırlamalar vardır, herhangi bir hücreyi özgüllüğü sahip değildir ve transfekte hücrelerinin sayısını kontrol altında tutmak zordur. ThereforeHowever, bu protokolü diğer tekniklerle birleştirerek daha farklı işleme yöntemleri için olanakları sağlayacaktır. İlk olarak, plazmid DNA hücre içine özel organizatörü birleştiren, nöronlar, glial hücreler ve astrositler hücre türüne özgü transfeksiyon sağlayacaktır. İkincisi, transfeksiyon geçici olduğundan, sonraki hayatında genin fonksiyonunu analiz etmek isteyen bilim adamları için uygun değildir. Bu nedenle, plazmid DNA genom entegre olmak için bir transposase ile birlikte istikrarlı bir transfeksiyon 8 dönüştürmek . Tet-veya tet-off sistemi, evlat edinme 8 sinir hücreleri veya hücre tipine özgü gen ekspresyonu zamanlama işlemek için mümkün kılacaktır. Alternatif olarak, bu protokol tamoksifen-indüklenebilir Cre-ER (T) recombinases 9 ve muhabir fareler 10 birleştirebilirsiniz. Dokuların Bu geniş erişilebilirlik nörobilim kullanılan deneysel tasarımları büyük ölçüde değişecektir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> çıplak tungsten tel çapı 125 mm </td><td> AM sistemleri </td><td> 797600 </td></tr><tr><td> çıplak platin tel çapı 125 mm </td><td> AM sistemleri </td><td> 767000 </td></tr><tr><td> Çubuk elektrotlar </td><td> Nepa gen </td><td> CUY610P4-1 </td></tr><tr><td> Cam kılcal tüp </td><td> Stoelting </td><td> 50611 </td></tr><tr><td> mikromanipülatör </td><td> KD Bilimsel </td><td> KDS310 </td></tr><tr><td> makas </td><td> ROBOZ </td><td> RS-5865 </td></tr><tr><td> darbe jeneratörü </td><td> AM Sistemleri </td><td> Model 2100 </td></tr><tr><td> 9 mm AutoCLIP </td><td> ROBOZ </td><td> RS-9260 </td></tr><tr><td> altın kaplama pinler </td><td> TEFE </td><td> 5482 </td></tr><tr><td> RORC &#39;ün antikor </td><td> Perseus Proteomik </td><td> H3925 </td></tr></tbody></table>

fare utero elektroporasyon: kontrollü spatiotemporal gen transfeksiyon

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Gelişmekte olan beyin, sinyal molekülleri ve akson rehberlik molekülleri, yerel gen transferi veya knock-out gereklidir dahil olmak üzere belirli bir bölgedeki genlerin işlevini anlamak için. Knock-knock-out hedefleme Gen yerel bölgeye belirli bir zahmetli, masraflı CRE hattı, ve zaman alıcı bir kombinasyonu ile gerçekleştirmek mümkün. Bu nedenle, basit bir transfeksiyon yöntemi, kısa sürede yapılabilir bir utero elektroporasyon tekniği, transgenik hayvanlar 1,2 nesil öncesinde aday genlerin olası fonksiyon testi için kullanışlı olacaktır. Buna ek olarak, in utero elektroporasyon, belirli bir CRE hattı var olan beyin alanları hedef ve embriyonik öldürücülüğü 3,4 sınırlayacaktır . Burada, biz, basit ve kullanışlı bir gen transferi için iki farklı tür elektrotlar birleştirerek gelişmekte olan beyin hedef alanlara utero elektroporasyon bir yöntem mevcut. İlk olarak, benzersiz bir optik fiber optik ışık kablosu kullanarak bir embriyo tutma yöntemi ventriküller ve hedeflenen beyin alanı 5,6 iğne tipi elektrodlar ekleme içine hedeflenen DNA çözüm enjeksiyon için görünür küçük embriyolar (E9.5) yapacaktır . Bu nedenle, kortikal alanı gibi beyin desenlendirme E9.5 bu erken elektroporasyon tüm alanı desenlendirme olayı anlamak için büyük bir katkı yapmak, erken embriyonik aşamada meydana gelir. İkincisi, bir kılcal kesin şeklini kılcal ekleme delik yaparak rahim zarar görmesini engeller. Ayrıca, iğne elektrotlar kesin şeklini tungsten ve platin tel ile oluşturulan ve zımpara kağıdı kullanarak bilenmiş ve tırnak cilası 7, bu protokol çok detaylı olarak açıklanan bir yöntem ile izole edilir. Bu benzersiz tekniği, beynin sınırlı alanlar içine plazmid DNA transfeksiyon sağlar ve küçük embriyolar electroporated olmasını sağlayacak. Bu, çok erken embriyonik aşamada hücre farklılaşması, hücre göçü, akson rehberliği üzerinde çalışıyoruz birçok bilim adamları için yeni bir pencere açmak için yardımcı olacaktır. Ayrıca, bu teknik, bilim adamları, birçok bölgeye özel CRE hatları fonksiyon kazanç (GOF) veya fonksiyon (LOF) analizleri kaybı var talamus ve hipotalamus, beyin gibi gelişmekte olan derin bölüme plazmid DNA transfect sağlayacaktır.

Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Sinyal molekülleri ve akson rehberliği dahil olmak üzere, gelişmekte olan beynin belirli bölgelerinde eksprese edilen genlerin işlevini anlamak için...

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik fare merkezi sinir sisteminde, istenen gelişimsel zaman noktasında ve beynin belirlenen bölgesinde etkili gen transfeksiyonu gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle rahim hasarını önlemek için hassas kılcalların ve iğne tipi elektrotların hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, hedeflenen DNA enjeksiyonu için küçük embriyoları görselleştirmek amacıyla fiber optik bir ışık kablosu kullanılarak embriyoların tutulmasına yönelik benzersiz bir yöntemi öğrenmektir.Prosedürün üçüncü adımı, DNA'yı beynin yüzeyel kısımlarına transfekte etmek için uterus yüzeyinde çubuk tipi elektrotlarla elektroporasyon gerçekleştirmektir; prosedürün son adımı ise talamus ve hipotalamus gibi beynin daha derin yapılarına iğne tipi elektrotlarla elektroporasyon uygulamaktır. Nihayetinde, kortikal tabaka spesifik transfeksiyonu veya talamusta etkili transfeksiyonu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin standart intrauterin enjeksiyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, uterustaki embriyoların enjeksiyon bölgesinin daha iyi görünürlüğünü ve kontrolünü sağlamasıdır.E 9.5 aşamasından itibaren embriyoları görselleştirmeyi mümkün kılan fiber optik benzeri bir kablo ve plazmid DNA'yı talamus ve hipotalamus gibi beynin daha derin bölgelerine iletmek için iğne hipozları kullanıyoruz. Bu yöntem, nöronal farklılaşma, beyin örüntülenmesi ve nöral bağlantısallık gibi gelişmekte olan beyne dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, iğneyi ve elektrodu şekillendirmenin ve kolektif konumlama yapmanın zorluğu nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.Uterus ve embriyolar. Bu yöntemin görsel gösterimi, hassas iğne elektrotlarının nasıl hazırlanacağını ve embriyoların elektroporasyon için nasıl konumlandırılacağını görmek açısından kritiktir. Çünkü bu iki adım, başarılı sonuçlar için temel teşkil etmektedir. Kılcal tüpleri hazırlamak için üretici talimatlarına uygun olarak bir mikropipet çekicisi kullanın.Bu prosedürde, iç lifi olmayan bir milimetrelik cam kapiler tüpler kullanıyoruz. Çekilmiş iğnelerin uçtan itibaren 800 mikrometre ile bir milimetre arasında ölçülmesi gerekir; bir diseksiyon mikroskobu kullanarak dış çapı 60 mikrometreden düşük olan iğne uçlarını, 20 ila 30 mikrometre çap olacak şekilde pensle kesin. Her bir iğneyi mikrometre ile ölçün.Ardından, sarma yöntemiyle mikro elektrotları hazırlayın. Tungsten telin bir ucunu altın kaplama bir pine sarın. Negatif elektrotlar için tungsten tel, pozitif elektrotlar için ise platin tel kullanın.Teli, param ile pine sabitleyin. Ardından teli bir pamuklu çubuğun plastik sapına yerleştirin ve her iki ucunu phim ile eşit şekilde sarın; telin ucunu, uç kısmında 20 ila 30 micrometers ve uçtan 800 micrometers ile bir millimeter arasındaki bölgede 60 micrometers genişliğe ulaşana kadar ince zımpara ile düzgünce sivriltin. Son boyutları tekrar bir mikrometre ile kontrol edin.Ardından, izolasyon sağlamak amacıyla telin tamamına ince bir katman uygulamak için sivrilmiş teli bir damla oje içerisine daldırın. Oje kuruduktan sonra, uç kısmındaki son 200 micrometers'lık alanı temizlemek için asetona batırılmış bir pamuklu çubuk kullanın. Platin elektrotlar hazır olarak satın alınır ve herhangi bir hazırlık gerektirmez.Bu prosedürde, CUY six 10 P four dash one nepo gen elektrodu kullanıyoruz. Plazma DNA'sını bir maxi prep veya eşdeğer bir yöntemle saflaştırın, 100 µg DNA'yı yeni bir tüpe aktarın ve 10 µL %1'lik fast green boyası ekleyin. Nihai 1 µg/µL plazma DNA konsantrasyonu için hacmi TE ile 100 µL'ye tamamlayın. Çözeltiyi pipetleme yoluyla nazikçe karıştırın, ardından safsızlıkları ve tuzları gidermek için DNA çözeltisini oda sıcaklığında 14.000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.SNAT'yi yeni bir tüpe aktarın. DNA çözeltisi, tüm prosedür boyunca tüp içinde oda sıcaklığında tutulabilir. Ardından, üretici talimatlarına uygun olarak çekilmiş bir iğneyi mikro manipülatöre bağlayın ve iğneyi doldurmak için iğne ucunu DNA çözeltisine daldırın.Mikromanipülatörü dikkatlice kenara alın ve ameliyat öncesi hazırlıkları yapın. Vücut ağırlığını belirlemek için embriyonik gün 9,5 ile 15,5 arasındaki gebe bir fareyi tartın.Ardından intraperitoneal olarak, vücut ağırlığının gram başına 50 mikrogram olacak şekilde farmasötik kalite sodyum pentobarbital enjekte edin ve beş dakika bekleyin. Sodyum pentobarbital alternatifi olarak ketamin, ksilazin enjeksiyonu veya gaz anestezikleri kullanılabilir.Anestezi sonrası, karın bölgesindeki tüyleri tıraş etmek için bir jilet ve %50 etanol kullanın. Cildi, Betadine ve %70 alkol ile sırayla ovarak temizleyin. İnce makasla abdominal orta hatta bir insizyon yapın.Tüm uterus kornularını dikkatlice, 1x fosfat tamponlu tuzlu su veya PBS ile nemlendirilmiş ve yaranın etrafına yerleştirilmiş pamuklu gazlı bez üzerine çıkarın. Uterusu sürekli olarak PBS ile nemli tutun. Esnek bir optik fiber kablo kullanarak.Kabloyu uterus kornusunun altına yerleştirin. Uterusu, optik fiber ışığı ile başparmağınız arasında konumlandırın ve embriyoyu uterus duvarına daha yakın olacak şekilde yukarı itmek için hafifçe sıkın. Embriyo, başı solda ve yukarı bakacak şekilde konumlandığında, cam kapilerle dikkatlice hedef ventriküle girin ve embriyonik 13.5. günde kortikal tabaka dördün elektroporasyonu için yaklaşık bir mikrolitre DNA solüsyonu enjekte edin.Çubuk platin elektrotları uterusun dışına yerleştirin ve 38 volt değerinde 50 milisaniye boyunca beş kez kare dalga akım darbeleri uygulayın. Embriyonik gün 10,5'te talamus veya hipotalamusa ulaşmak için mikro elektroporasyon kullanılıyorsa, ince tungsten negatif elektrodu DNA enjekte edilen ventriküle, platin pozitif elektrodu ise uterusa yerleştirin. Hedef bölgeyi her iki elektrodun uçları arasına konumlandırın ve önerilen kare dalga akım darbelerini yedi volt değerinde 100 milisaniye boyunca üç kez uygulayın.Elektroporasyon tamamlandıktan sonra, uterus kornusunu orijinal konumuna geri getirin ve 500 µL PBS ekleyin. İnsizyonun iç katmanını cerrahi bir sutur ile dikin. Ardından dış katmanı dokuz milimetrelik bir otomatik klips ile kapatın.Farenin cerrahi işlemden ve anesteziden etkilerini atlatması için iki saat boyunca ısıtıcı ped üzerinde bekletin. Burada, embriyonik 13,5, 14,5 ve 15,5 günlerinde uygulanan kortikal bölge platin elektroporasyonu görülmektedir. Beyinler postnatal dönemde hasat edilmiştir.Altıncı gün. Elektroporasyon yapılan kortikal hücre tabakası her deneyde belirgin şekilde farklıdır. Bu durum, zamana bağlı elektroporasyonun, kortikal tabakalara özgü fonksiyon kazanımı ve fonksiyon kaybının mümkün olduğunu göstermektedir.Burada gösterildiği gibi, talamus ve hipotalamus gibi derin dokulara elektroporasyon uygulanışı. Çubuk platin elektrotlar kullanmak genellikle düşük verimlilik sağlar; elektroporasyon için mikro elektrotlar kullanmak, bu derin dokularda daha iyi verimlilik ve canlılık sunar.Plazmid DNA çözeltisini fare embriyolarının üçüncü ventrikülüne enjekte ettik. Embriyonik 11,5. günde, iğne elektroporasyonuyla sadece talamusa uygulama yaptık; talamus eksonlarının çoğu postnatal altıncı güne kadar kortekse projeksiyon yapar. Burada, gelişmekte olan sefalona P-C-A-G-E-Y-F-P mikro elektroporasyonu uygulamasını gösteriyoruz.Talamus bölgesi, tüm talamik post-mitotik nöronları işaretleyen RORC ile gösterilmiştir. Korteksin dördüncü tabakasına doğru beyaz oklarla gösterilen akson projeksiyonları, aynı zamanda tüm nöronu dolduran EYFP ile de görselleştirilebilir. Korteksteki dördüncü tabakanın konumu da RORC antikoru ile işaretlenmiştir.MA başladığında, bu teknik doğru şekilde uygulandığında litre başına 15 dakikada tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, işlem sonrası herhangi bir hasarı önlemek için test tüpünü çok dikkatli tutmanız gerektiğini unutmamak önemlidir. Hücre spesifikasyonunun gelişiminden sonraki moleküler mekanizmayı anlamak için, MDNA'ya spesifik bir kromofor eklemek gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.Bu teknik, merkezi sinir sistemi gelişim alanıyla ilgilenen araştırmacıların; örüntü oluşumu, aksonal büyüme ve devre oluşumundaki moleküler mekanizmaları keşfetmelerine olanak sağlar.

mouse-utero-electroporation-controlled-spatiotemporal-gene

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

Burada fare retina ganglion hücrelerinin (RGCs) gen ekspresyonu işlemek için iki teknik...

Fare Retina Ganglion Hücreleri Gen İfadesi utero ve ex vivo Elektroporasyon

Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Fare iç kulak olan gelişim programı gebelikte özenli bir taslakları kaynaklı duyu organıdır. Biz bir...

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporasyon

Kaynak: Lutz, D., et al. Gelişmekte Olan Fare Beyin ve Omuriliğinin İn Utero Transdüksiyonu Sonrası Ultrastrüktürel Nöroplastisite Parametrelerinin Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2019).Bu video, fare embriyolarında rahim içi enjeksiyon yoluyla viral transdüksiyonu göstermektedir. Ameliyat için hamile bir fare hazırlanır ve rahim boynuzlarını ortaya çıkarmak için orta hat kesisi yapılır. İstenilen geni içeren bir virüs ve takip boyası karışımı, hedeflenen yerlerde rahim keseleri içindeki...

Bir farede utero viral transdüksiyon

Hipotalamusun fonksiyonel ve tıbbi önemine...

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Bu protokol, in utero elektroporasyon yoluyla C57BL/6 merkezi sinir sistemindeki farklı bölgelerin spesifik olarak nasıl transfekte edileceğini ayrıntılı olarak açıklar. Bu protokolde korteks, hipokampus, talamus, hipotalamus, lateral septal çekirdek ve striatuma dönüşen bölgelerin transfeksiyonları için ayrıntılı talimatlar bulunmaktadır.

Korteks, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- ve Striatum özgü<em&gt; In Utero</em&gt; C57BL / 6 Fare Elektroporasyon

Uteros elektroporasyonda çift mekansal ve zamansal olarak ayrılmış hücre popülasyonları hedefleme sağlar. Bu teknik, bu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimleri normal koşullarda floresan proteinler ihsallaştırmak için değil, aynı zamanda fonksiyonel deneylerden sonra ilgi genlerini tedirgin etmek için görselleştirmek için yararlıdır.

Geçici ve Mekansal Olarak Ayrılmış Hücre Popülasyonlarını Hedef lemek için Utero Elektroporasyonunda Çift

Bu protokolde, E7.5'teki fare amniyotik boşluğunun lentivirüs ile nasıl enjekte edileceğini açıklıyoruz, bu da tüm sinir plakasının düzgün bir şekilde transdüksiyonuna yol açarak, hayatta kalma veya embriyonik gelişim üzerinde minimum zararlı etkiye sahiptir.

Embriyonik Gün 7.5'te In Utero Nano-Enjeksiyon (NEPTÜN) ile Murin Nöral Plaka Hedefleme

Burada, fare plasentasındaki kritik gelişim yollarını in vivo olarak etkili bir şekilde manipüle etmek için zamana özgü bir yöntem açıklıyoruz. Bu, embriyonik gün 12.5'te CRISPR plazmidlerinin hamile barajların plasentalarına enjeksiyonu ve elektroporasyonu yoluyla gerçekleştirilir.

Fare In Vivo Plasental Hedefli CRISPR Manipülasyonu

Öğrenin fare embriyonik merkezi sinir sisteminde hassas gen transfeksiyonu için uterus içi elektroporasyon yöntemini. Fiber optik görüntüleme ve özel iğne elektrotları ile korteks ve talamus gibi derin beyin yapılarına kontrollü DNA aktarımı sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Daha fazla video keşfet