Bakteriyel Enfeksiyon Kantitasyon Testi: Bakteriyel Endoftalmilerin Fare Modelinde Göz İçi Bakteri Yükünü Ölçmek İçin Bir Yöntem

Bakteriyel endoftalmi, patojenik bir bakteri olan Bacillus cereus'un göz içi bölgesini enfekte etmesiyle ortaya çıkan inflamatuar bir göz rahatsızlığıdır.

Bakteriyel enfeksiyonu ölçmek için, ötenazi yapılmış bir bakteriyel endoftalmi fare modelini ameliyat masasına lateral olarak yerleştirin. Göz küresini yuvadan çıkarmaya yardımcı olmak için göz altına hafif bir baskı uygulayın. Göz küresini, proteaz inhibitör kokteyli ile desteklenmiş uygun bir tampon içeren bir tüpe aktarın.

Oküler dokuyu parçalamak için homojenize edin, süspansiyondaki bakterileri serbest bırakın. Tamponda bulunan proteaz inhibitörleri, bakteri canlılığını korumak için salınan hücresel proteazları inaktive eder. Daha sonra, çeşitli konsantrasyonlarda Bacillus cereus elde etmek için bakteriyel süspansiyonu seri olarak seyreltin.

Zenginleştirilmiş agar ortamını içeren açılı bir kültür plakası alın ve her seyreltme konsantrasyonuna karşılık gelen satırları ayırın. Belirlenen sıranın üstündeki bakteri süspansiyonundan birkaç damla damlatın ve plakanın sonuna ulaşana kadar aşağı akmasına izin verin, bu da bakterilerin düzgün bir şekilde yayılmasına yardımcı olur. Plakayı düzleştirin ve inkübe edin.

Kuluçka sırasında, her bakteri çoğalmak ve bireysel koloniler oluşturmak için agardan gelen besinleri kullanır. Koloni sayısı azalır, bu da bakteri süspansiyonunun seyreltilmesindeki bir artışa karşılık gelir. Oküler bakteri yükünü ölçmek için belirli bir sıradaki koloni sayısını sayın.

Uygun deneysel son noktada, proteaz inhibitörü ile desteklenmiş 400 mikrolitre PBS'yi, buz üzerindeki göz başına etiketli bir otoklavlanmış hasat tüpüne ekleyin ve enfekte gözün her iki tarafına açık, ince uçlu forseps yerleştirin. Gözü desteklemek için uçları başa doğru itin.

Maşa göz küresinin arkasına geçtiğinde, maşayı birbirine sıkın ve göz küresini ayırmak için forsepsleri kafadan çekin. Ardından, göz küresini hemen uygun şekilde etiketlenmiş hasat tüpüne yerleştirin. Numune alındıktan sonraki 60 dakika içinde, kapalı hasat tüplerini bir doku homojenizatörüne yerleştirin ve numuneleri, aralarında 30 saniyelik bir dinlenme periyodu olacak şekilde birer dakikalık iki homojenizasyon periyodu için homojenize edin.

Homojenizasyondan sonra, numuneleri buz üzerine yerleştirin ve numuneleri 1 çarpı 10 üzeri negatif 8'e ulaşılana kadar seyreltme başına 180 mikrolitre PBS içinde seri olarak seyreltmek için 20 mikrolitrelik homojenat alikotları kullanın. Daha sonra, önceden ısıtılmış kare bir BHI plakasının her bir sırasını uygun seyreltme konsantrasyonu ile etiketleyin ve plaka 45 derecelik bir açıyla eğilmiş durumdayken, plakanın üst kısmındaki ayrı sıralara her seyreltmeden 10 mikrolitre ekleyin. Plakayı düz bir şekilde yerleştirmeden önce her numunenin neredeyse plakanın dibine ulaşana kadar çalışmasına izin verin. Numuneler agar içine emildiğinde, plakayı 37 derecelik bir inkübatöre aktarın. Koloniler sekiz saatlik kuluçka süresinden sonra görünür olmaya başlamalıdır.

Numunedeki konsantrasyonun doğru bir temsili için, 10 ila 100 koloni içeren satırı sayın.