IPE ve RPE Hücrelerinin İzole Edilmesi: Tavşan Gözünden Oküler Pigment Epitel Hücrelerinin Elde Edilmesi İçin Bir Teknik

Pigment epitel hücreleri, sıkı bağlantılarla birbirine bağlanmış terminal olarak farklılaşmış küboidal hücrelerdir. İrisi kaplayan bu epitel hücreleri, iris pigment epitel veya IPE hücreleridir ve retinaya yakın olanlar, retina pigment epitel veya RPE hücreleridir.

Bu hücreleri çıkarmak için sağlam bir tavşan gözü alın. Göz yüzeyindeki mikroorganizmaları temizlemek için göze bir dezenfektan uygulayın. Dezenfektanı bir tampon solüsyonla yıkayın. İrisin yakınında bir kesi yapın. Bu açıklığı kullanarak, iris sınırı boyunca tam bir dairesel kesim yapın, gözü iris içeren bir ön segmente ve retina ve vitreus mizahı içeren bir arka kısma bölün

Ön segmenti alın ve irise erişmek için lensi atın. İrisi çıkarın ve bir kültür kabına koyun. Daha sonra, arka segmenti alın ve jelatinimsi vitreus mizahını ve retinayı göz ampulünden atın.

İris ve göz ampulünü tripsin ile tedavi edin ve inkübe edin. Tripsin, sıkı bağlantıyı ve hücre dışı matris proteinlerini bozarak epitel hücrelerinin ayrışmasını başlatır. Tripsini atın ve uygun bir kültür ortamı ekleyin. Ortamdaki epitel hücrelerini serbest bırakmak için iris ve göz ampulü yüzeyini nazikçe kazıyın.

Son olarak, IPE ve RPE hücrelerini ayrı kuyucuklarda tohumlayın. Hücreler daha sonraki aşağı akış tahlilleri için hazırdır.

Hayvana ötenazi yaptıktan sonra, gözleri enüklee etmek için kavisli makas ve Colibri forseps kullanın, ardından kalan kas dokusunu ve cildi gözlerden temizleyin. Gözleri steril olmayan PBS ile doldurulmuş 50 mililitrelik bir tüpte toplayın ve tüpü laminer akış başlığına aktarın. İyot bazlı solüsyona iki dakika batırarak dezenfekte edin, ardından gözleri steril PBS ile doldurulmuş 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Bir gözünüzü steril bir gazlı bez kompresine koyun ve gözü optik sinire sıkıca yakın tutun, ardından # 11 neşter ile irisin sınırına yakın bir yerde kesin. Makas kullanarak, irisin etrafını kesin ve ön segmenti çıkarın ve retina pigment epiteli veya RPE hücreleri izole edilene kadar ampulü vitreus ile bırakarak bir Petri kabına koyun.

İris pigment epitelini veya IPE hücrelerini izole etmek için, lensi ince forsepslerle çıkarın ve IPE hücrelerini içeren irisi nazikçe dışarı çekin. İrisi bir Petri kabına yerleştirin ve steril PBS ile yıkayın. 500 mikrolitre% 0.25 tripsin ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Tripsini çıkarın, 500 mikrolitre tam ortam ekleyin ve IPE'yi düz ateşte parlatılmış bir Pasteur pipeti ile hassas bir şekilde kazıyın.

Hücre süspansiyonunu toplayın ve 1.5 mililitrelik bir tüpe koyun. Neubauer odasını kullanarak hücreleri sayın ve 1 mililitre tam ortam içeren 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 0,2 milyon hücre tohumlayın. Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültürleyin.

RPE hücrelerini izole etmek için, vitreus mizahını ve retinayı ince forseps ile arka segmentten çıkarın. Ampulleri 24 oyuklu bir tabağa koyun ve göz başına 500 mikrolitre% 0.25 tripsin ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Tripsini çıkarın, küre başına 500 mikrolitre tam ortam ekleyin ve RPE hücrelerini kavisli ateşle parlatılmış bir Pasteur pipeti ile hassas bir şekilde kazıyın.

Hücre süspansiyonunu toplayın ve 1.5 mililitrelik bir tüpe koyun. Neubauer odasını kullanarak hücreleri sayın ve hücreleri daha önce açıklandığı gibi tohumlayın. Plakayı inkübatöre yerleştirin.