JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyoloji
0 görüntülenme • 4:35 dk. • July 8th, 2025
Bronşiyoller, akciğerlerin tübüler hava yollarıdır. Kronik enfeksiyon sırasında, mukus birikimi nedeniyle bronşiyoller tıkanır. Besin açısından zengin mukus, fırsatçı bakterilerin büyümesi için uygun bir ortam sağlar. Bu bakteriler kendi kendine üretilen hücre dışı polimerik matrise gömülür ve bir biyofilm oluşturmak üzere çoğalır.
Akciğerlerde bakteriyel biyofilm gelişimini taklit etmek için, bir Petri kabında bir domuz bronşiolar doku örneği alın. Dokuyu istenen şekle sahip parçalara ayırın. Petri kabına bir biyofilm kültür ortamı ekleyin. Yüzeydeki kirleticileri gidermek için tabağı UV ışığı altında sterilize edin.
Sterilize edilmiş doku parçalarını, bakteri yapışması için optimum bir substrat görevi gören biyofilm kültür ortamı ve agaroz pedleri içeren çok kuyulu bir plakaya aktarın. Daha sonra, planktonik bakterileri dokuya sokmak için her doku parçasına istenen bakterinin bir kolonisini içeren bir iğne ucu batırın. Plakayı, plaka yüzeyi boyunca eşit oksijen değişimini kolaylaştıran UV ile sterilize edilmiş, gözenekli bir zarla kapatın. Mühürlü plakayı inkübe edin.
Kuluçka sırasında bakteriler pili yoluyla epitel yüzeyine geri dönüşümsüz olarak yapışır ve hücre dışı matrisi salgılamaya başlar. Matris içinde bakteriler, biyofilmler oluşturmak için kültür ortamından enerji kaynaklarını, müsini ve serbest DNA'yı kullanır. Bakteriyel biyofilm modeli daha fazla test için hazırdır.
Bronşiyolu ilk DMEM / RPMI 1640 yıkamasına yerleştirin. Yıkamada bırakın ve planlanan deney için yeterli doku kesiti elde etmek için aynı akciğerden ek bronşiyol bölümleri toplayın. Aynı akciğerden herhangi bir ek bronşiolar bölümü yıkamaya yerleştirin ve en az iki dakika yıkamada bırakın.
Bronşiyolleri ilk yıkamadan çıkarın ve numuneleri steril bir Petri kabına koyun. Hafifçe her bronşitolü steril forseps ile tutun ve dokuya zarar vermemeye dikkat edin. Mümkün olduğu kadar çok kalan yumuşak dokuyu çıkarın ve steril diseksiyon makası kullanarak dokuyu beş milimetre genişliğinde şeritler halinde kesin.
Tüm bronşiolar doku şeritlerini ikinci DMEM / RPMI 1640 yıkamasına yerleştirin. Onları en az iki dakika yıkamada bırakın. Daha sonra, steril forseps kullanarak doku şeritlerini ikinci yıkamadan çıkarın ve temiz, steril bir Petri kabına yerleştirin. Bronşiole bağlı kalan yumuşak dokuyu çıkarın ve steril diseksiyon makası kullanarak şeritleri kareler halinde kesin.
Üçüncü DMEM/RPMI 1640 yıkamasını Petri kabına ekleyin ve kabı döndürerek yıkamadaki doku parçalarını hafifçe karıştırın. Doku parçalarını çıkarmadan üçüncü yıkamayı Petri kabından dökün.
Ardından, tüm doku parçalarının kaplandığından emin olarak son SCFM yıkamasını ekleyin. Dokuyu SCFM'de UV ışığı altında beş dakika sterilize edin. Her sterilize edilmiş bronşiolar doku parçasını, SCFM agaroz pedleri içeren 24 oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına aktarmak için steril forseps kullanın.
Her bir doku parçasını istenen bakteri suşu ile enfekte etmek için, steril 0.5 mililitrelik bir insülin şırıngasına bağlı 29 gauge bir iğnenin ucu ile bir agar plakası üzerinde yetiştirilen bir koloniye dokunun. Ardından, koloniyi doku parçasına dokundurun ve yüzeyi nazikçe delin. Enfekte olmayan kontroller için, doku parçasının yüzeyini iğnenin ucuyla nazikçe delin.
Ardından, her kuyucuğa 500 mikrolitre SCFM eklemek için bir pipet kullanın. Ultraviyole ışık altında her 24 oyuklu plaka için nefes alabilen bir sızdırmazlık membranını 10 dakika sterilize edin. Kapağı 24 oyuklu plakadan çıkarın ve nefes alabilen zarla değiştirin. Ardından, plakaları sallamadan 37 santigrat derecede inkübe edin.