Domuz Aort Endotel Hücresi (pAEC) İzolasyonu: Hasat Edilen Domuz Abdominal Aortundan Endotel Hücrelerini İzole Etmek İçin Enzim Tabanlı Bir Yöntem

Oksijenli kanı kalpten vücuda taşıyan ana arter olan aort, üç katmandan veya 'tuniklerden' oluşur: bir iç intima, bir orta medya ve bir dış adventitia. Endotel hücreleri veya EC'ler, intimada, başta kollajen olmak üzere yapısal proteinlerden oluşan destekleyici bir bazal membran üzerinde ince, sürekli bir tek tabaka olarak bulunur.

EC'leri izole etmek için, bir kültür kabında hasat edilmiş bir domuz aortu ile başlayın. Endotel dışı hücre kontaminasyonunu önlemek için uçlarını ve çevresindeki yapışık dokuları eksize edin. Mikrobiyal büyümeyi engellemek için aortu antibiyotik içeren tamponla yıkayın.

Aorttan steril bir cerrahi dikiş geçirin ve dikişi lümen içinde tutarak uçlarından birini bağlayın. Bağlı ucu sabitleyin ve aortu tamamen ters çevirmek için dikişi geri çekin. Bu, EC içeren intimayı enzimatik sindirime maruz bırakır. Optimal enzim aktivitesi için aortu önceden ısıtılmış, düşük konsantrasyonlu kollajenaz çözeltisi ile tedavi edin ve inkübe edin.

Kollajenaz, EC'lerin altında yatan bazal zarda bulunan kollajen proteinlerini parçalayarak ayrışmalarını başlatır. İnkübasyon sonrası, kollajenaz enzimlerini etkisiz hale getirmek için soğutulmuş tampon ekleyin.

Aort intimal yüzeyini nazikçe kazıyın ve EC'leri solüsyona bırakmak için tamponla durulayın. EC'leri peletlemek için bu çözeltiyi santrifüjleyin. Peleti uygun ortamda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu bir kültür şişesine tohumlayın ve inkübe edin. EC'ler şişenin dibine yapışır ve çoğalır.

Domuz aort endotel hücresi izolasyonu için, domuz aortunu aseptik koşullar altında 150 milimetrelik Petri kabına aktarın ve damarın her iki ucunu nazikçe çıkarın. Damarın klemplendiği yerdeki fazla dokuyu steril forseps ve makasla kesin ve aortun dışını ve içini durulamak için 20 ila 50 mililitre taze yıkama tamponu kullanın.

Daha sonra, aorttan cerrahi bir dikiş geçirin ve damarın bir ucunu gevşek bir şekilde bağlayın ve dikişi lümen içinde tutun. Aortu forseps ile bağlı ucun yakınına nazikçe sabitleyin ve ardından aortun endotel yüzeyi açığa çıkana kadar aortu tersine çevirmek için cerrahi dikişleri yavaşça çekin.

Aortun endotel yüzeyini yıkama başına 10 mililitre taze yıkama tamponu ile üç kez yıkayın ve aortu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Numuneyi 10 mililitre 37 santigrat derece ısıtılmış% 0.005 kollajenaz IV sindirim çözeltisi ile örtün ve dokuyu 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, tüm tüp içeriğini 100 milimetrelik bir kültür kabına aktarın ve sindirimi 10 ila 15 mililitre önceden soğutulmuş durdurma tamponu ile durdurun. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, aort endotel hücrelerini damarın iç yüzeyinden nazikçe çıkarın ve kabı yıkama başına 5 mililitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.

Son yıkamadan sonra, süpernatanı 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve kültür kabının tabanını yıkama başına 5 mililitre taze yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve yıkamaları 50 milimetrelik tüpte toplayın.

Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve son 10 mililitre süpernatan hariç hepsini atın. Peletleri yeniden süspanse etmek için 20 mililitre yıkama tamponu ekleyin, kabarcıkları önlemeye dikkat edin ve hücreleri başka bir santrifüjleme ile toplayın.

Peletleri saymak için 1 mililitre hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri 25 santimetre kare şişe konsantrasyonu başına 1 x 10 ila 6 hücrede plakalayın. Ardından, hücreleri hücre kültürü inkübatörüne 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit ile yerleştirin ve ortamı her 2 ila 3 günde bir yenileyin.