JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyoloji
0 görüntülenme • 2:31 dk. • July 8th, 2025
Embriyo çözdürme, dondurularak saklanmış donmuş embriyoların ısıtıldığı ve yeniden sulandırıldığı, biyolojik aktivitelerinin geri kazanıldığı bir işlemdir.
Dondurularak saklanmış tavşan embriyolarını kapalı bir kriyojenik pipette çözmek için, pipeti sıvı nitrojenden çıkarın. Minimum hacimde kriyoprotektan içeren besiyerine sahip embriyolar, pipet içindeki hava ve medya segmentleri ile fiziksel olarak izole edilir. Pipeti kısa bir süre için havaya yerleştirin, aksi takdirde daha yüksek sıcaklıklara maruz kalma sırasında embriyo hasarına neden olan sıkışmış sıvı nitrojen buharlarının salınmasını kolaylaştırın.
Kriyojenik sıvı nitrojen sıcaklıklarından daha yüksek donma sıcaklıklarına hızlı yükseliş, kriyojenik saman içinde buz kristali oluşumunu başlatarak embriyo hasarı riskini taşır. Buz kristalleri oluşmaya başladığında, pipeti hemen eşit çözülme için hafif çalkalama ile sıcaklık kontrollü bir su banyosuna daldırın. Bu adım, embriyoları buz kristali hasarından koruyarak buz kristallerini ortadan kaldırır.
Saman tapasını çıkarın. Pipetin kapalı ucunu kesin; İçeriği sakaroz içeren ortam içeren bir kültür plakasına bırakmak için bir mikro dağıtıcı takın. Ortam, kriyoprotektanların embriyolardan uzaklaştırılmasına yardımcı olur; Sükroz, embriyoların aşırı şişmesini önler ve rehidrasyon sırasında fizyolojik ortamlarını eski haline getirir.
Kriyoprotektanları tamamen çıkarmak için embriyoları taze ortam içeren bir plakaya aktarın ve tam rehidrasyon sağlayın. Çözdürülen embriyolar embriyo transfer işlemleri için hazır hale gelir.
Embriyoları transfer için çözmek için, mini pipeti sıvı nitrojen buharından 10 ila 20 saniye boyunca 30 santimetre uzağa yatay olarak yerleştirin. Mini pipetin içinde kristalleşme süreci başladığında, pipeti 10 ila 15 saniye boyunca 25 santigrat derecelik bir su banyosuna daldırın. Saman ve pamuk tapalarını hemen çıkarın ve mini saman içeriğini, embriyoların 5 dakika boyunca kalması gereken 0.33 molar sükroz çözeltisi ile desteklenmiş 25 santigrat derece baz ortamı içeren bir plakaya çıkarmak için birleştirilmiş bir mikro dağıtıcı kullanın. Daha sonra, embriyoları 5 dakikalık bir inkübasyon için taze baz ortamından oluşan bir tabağa aktarın.