Çinko Parmak Nükleaz Tabanlı Genom Düzenleme: İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde Çift Sarmallı Homoloji Bağımlı Onarım Mekanizması ile Genomu Değiştirme Tekniği

Çinko parmak nükleazı veya ZFN, bir bağlayıcı aracılığıyla bir endonükleaz alanına bağlı bir çinko iyonu stabilize edilmiş, DNA bağlayıcı makro alanı içerir. Bu yapı, DNA'yı keserken özgüllüğün korunmasına yardımcı olur.

Genom düzenleme için ZFN'leri kullanmak için, insan pluripotent kök hücrelerinin bir kültürünü alın. ZFN'yi kodlayan bir plazmid ile destekleyin. Hedef geni ve homoloji kolları veya HA'lar arasına sıkıştırılmış antibiyotik direnç genini içeren bir onarım plazmidi ekleyin. Elektrik akımının hücre içine plazmitlerin girişini kolaylaştırdığı hücre-DNA karışımını elektropoze edin.

İçeri girdikten sonra, çevrilmiş ZFN'nin çinko parmak motifleri, konakçı genomundaki tamamlayıcı baz çiftlerinin üçlülerine bağlanır ve Fok-1 kısıtlama endonükleazını hedef bölgede doğru bir şekilde konumlandırır. ZFN'ler, Fok-1 homodimerizasyonunun, Fok-1'in DNA çift sarmallı kırılmalar veya DSB'ler oluşturduğu ve dört nükleotid çıkıntısı ürettiği aktif bir katalitik merkez oluşturmasına izin veren çiftler halinde zıt ipliklere bağlanır.

Onarım plazmidinde HA'ların varlığı, sarkan ucun ters döndüğü ve homolog HA dizisini bir şablon olarak kullandığı homolojiye bağlı onarıma rehberlik eder. DNA sentezi, hedef gene tamamlayıcı nükleotidler eklenerek devam eder.

Ortaya çıkan boşluklar bağlanır ve gen eklenmesini kolaylaştırır. Ek olarak, promotörüz antibiyotik direnç geni, yerleştirme bölgesinin yukarısındaki bir konakçı promotöründen eksprese edilir. Başarılı bir şekilde düzenlenmiş hücreler antibiyotik seçim ortamında büyür.

Jelatin üzerinde büyütülen mitomisin C ile inaktive edilmiş Fare Embriyonik Fibroblast veya MEF, besleyici hücreler içeren 6 oyuklu bir plaka üzerinde hESC ortamında insan pluripotent kök hücrelerini kültürleyerek başlayın. Kaplamadan sonraki her gün, hPSC %50 birleşme noktasına ulaşana kadar, tüm ortam hacmini çıkarmak için bir cam pipet ve vakum kullanın. Oyuk başına 3 mililitre ılık hESC ortamı ile değiştirin.

Hedeflemeden bir gün önce, hESC ortamını çıkarın ve 10 mikromolar Y27632 ile desteklenmiş, önceden ısıtılmış yeni hESC ortamını ekleyin. Ayrıca, DR4 farelerinden bir ila iki adet 6 oyuklu ilaca dirençli MEF besleyici hücre plakası hazırlayın. Hedefleme gününde, 5 mikrogram çinko parmak nükleaz ekspresyon plazmidi 1 ve 2'yi 1.5 mililitrelik bir tüpe pipetleyerek transfeksiyon solüsyonlarını hazırlayın.

30 mikrogram onarım donörü plazmidi ekleyin, ardından hacmi 300 mikrolitreye getirmek için yeterli 1X Fosfat Tamponlu Salin ekleyin. % 50 birleşme sağlamak için hücreleri mikroskop altında inceleyin. Ardından, ortamı hPSC plakasından çıkarmak için bir cam pipet ve vakum kullanın. Ardından, hücreleri 2 mililitre ılık 1X PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire ettikten sonra, doğrudan hücrelerin üzerine 0.5 mililitre% 0.25 tripsin EDTA çözeltisi ekleyin.

Doku kültürü inkübatörüne yaklaşık 10 dakika veya besleyici tabaka plakadan kalkmaya başlayana kadar yerleştirin. İnkübasyonun ardından, tripsin reaksiyonunu durdurmak için her bir kuyucuğa 2 mililitre ılık esWash ortamı ekleyin. Hücreleri her kuyucuktan toplayın ve besleyici hücrelerin bir tabaka halinde çıkmasını sağlayın. Her bir oyuğun içeriğini, tüm oyukları birleştirerek 50 mililitrelik tek bir konik tüpe pipetleyin ve hücreleri 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak ezin.

Hücre süspansiyonunu 40 mililitreye getirmek için esWash ortamı ekleyin. Büyük besleyici parçalarının tüpün dibine yerleşmesine izin vermek için bir ila iki dakika bekleyin, ardından süpernatanı serolojik bir pipet kullanarak çıkarın ve 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe bırakın. Hücre süspansiyonunu 190 x g'da beş dakika santrifüjledikten sonra, hücre peletini bozmadan süpernatanı aspire edin. Hücreleri 500 mikrolitre 1X PBS'de yeniden süspanse edin.

Yeniden süspanse edilmiş hücreleri daha önce hazırlanan plazma transfeksiyon çözeltisi ile birleştirin. Hücreleri ve transfeksiyon karışımını 4 milimetrelik bir elektroporasyon küvetine pipetleyin ve üç ila beş dakika boyunca buzun üzerine koyun. Elektroporasyon sistemindeki üstel programın parametrelerini 250 volt, 500 mikroFarad, sonsuz direnç ve 4 milimetre küvet boyutuna ayarlayın. Hücreleri elektriklendirin ve ardından küveti üç dakika boyunca tekrar buzun üzerine yerleştirin.

Elektroporasyonlu hücreleri, 10 mikromolar Y27632 ile desteklenmiş 18 mililitre ılık hESC ortamında yeniden süspanse edin. DR4 MEF'leri mikroskop altında inceleyin. DR4 besleyici hücreleri içeren 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna tek hücreli süspansiyonun 3 mililitresini plakalayın ve inkübatöre geri dönün. Kaplamadan sonraki üçüncü günde, hücrelerdeki ortamı Y27632 içermeyen hESC ortamıyla değiştirin. 4. günde, takviye edilmemiş medyayı uygun seçim antibiyotiği içeren medya ile değiştirin. Puromycin burada kullanılır.