Çinko Parmak Nükleaz Tabanlı Genom Düzenleme: İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde Çift Sarmallı Homoloji Bağımlı Onarım Mekanizması ile Genomu Değiştirme Tekniği

Çinko parmak nükleazı veya ZFN, bir bağlayıcı aracılığıyla bir endonükleaz alanına bağlı bir çinko iyonu stabilize edilmiş, DNA bağlayıcı makro alanı içerir. Bu yapı, DNA'yı keserken özgüllüğün korunmasına yardımcı olur.

Genom düzenleme için ZFN'leri kullanmak için, insan pluripotent kök hücrelerinin bir kültürünü alın. ZFN'yi kodlayan bir plazmid ile destekleyin. Hedef geni ve homoloji kolları veya HA'lar arasına sıkıştırılmış antibiyotik direnç genini içeren bir onarım plazmidi ekleyin. Elektrik akımının hücre içine plazmitlerin girişini kolaylaştırdığı hücre-DNA karışımını elektropoze edin.

İçeri girdikten sonra, çevrilmiş ZFN'nin çinko parmak motifleri, konakçı genomundaki tamamlayıcı baz çiftlerinin üçlülerine bağlanır ve Fok-1 kısıtlama endonükleazını hedef bölgede doğru bir şekilde konumlandırır. ZFN'ler, Fok-1 homodimerizasyonunun, Fok-1'in DNA çift sarmallı kırılmalar veya DSB'ler oluşturduğu ve dört nükleotid çıkıntısı ürettiği aktif bir katalitik merkez oluşturmasına izin veren çiftler halinde zıt ipliklere bağlanır.

Onarım plazmidinde HA'ların varlığı, sarkan ucun ters döndüğü ve homolog HA dizisini bir şablon olarak kullandığı homolojiye bağlı onarıma rehberlik eder. D