Yapışık Kültürlenmiş Hücrelere Nükleik Asitleri Sokmak için Boncuk Yükleme: Floresan Protein Kodlayan Plazmitleri Yapışık Memeli Hücrelerine Yüklemek İçin Bir Teknik

Bir kültür plakasında yapışık memeli hücrelerinin bir kültürü ile başlayın. Sterilize edilmiş, alkali ile işlenmiş, mikron boyutlu cam boncukları özelleştirilmiş bir boncuk yükleyici aparatının haznesine aktarın. Yükleme sırasında boncukların geçmesine izin vermek için optimum boyutta açıklıklara sahip bir ağ kullanarak hazne açıklığını kapatın. Ağı bir görüntüleme odası tertibatı ile sabitleyin.

Ortamı plakadan çıkarın. Hücreler üzerinde eşit dağılım için floresan raportör protein kodlayan plazmit DNA'nın bir süspansiyonunu plakaya pipetleyin. Boncuk yükleyici aparatını kullanarak, hücrelerin üzerine tek katmanlı bir cam boncuk yavaşça dağıtın. Kültür plakasına uygun kuvvetle kısa bir süre vurun.

Cam boncuklar kısa bir süre yapışan hücrelerin üzerinde yuvarlanırken, alkali işlem onları hücrelere daha az yapışkan hale getirir. Boncuklar ve hücreler arasındaki çarpışmaların etkisi, hücresel zarlarda lokalize bozulmalar yaratarak yeterli zorlanmayı iletir. Oluşan bu küçük boyutlu geçici gözenekler, büyük boncukların girişini engellerken plazmit DNA'nın hücrelere alımını kolaylaştırır.

İyileşme süresi boyunca, hücre zarı yeniden kapanır, zar bütünlüğünü geri kazandırır ve plazmit DNA'yı hapseder. Plakaya ortam ekleyin ve plakadan görünür yüzen boncukları dikkatlice aspire edin. Plakayı inkübe edin.

Plazmit DNA içeren başarılı bir şekilde transfekte edilmiş hücreler, bir floresan mikroskobu altında görüntülenebilen floresan raportör proteinleri eksprese eder.

Ortamı hücrelerden çıkarın ve tüm ortamı odanın kenarlarından nazikçe aspire edin. Ardından, hazneyi yaklaşık 45 derecelik bir açıyla eğin ve merkezi mikro kuyuda kalan ortam damlasını çıkarın. Boncuk yükleme solüsyonunu, haznenin ortasında bulunan cam mikro kuyuya nazikçe pipetleyin.

Hücrelerin üzerine tek katmanlı bir cam boncuk tabakasını nazikçe dağıtmak için boncuk yükleme aparatını kullanın. Boncukların hücreleri tamamen kapladığından emin olun. Hazneyi iki parmağınızla sıkıştırın. Yaklaşık iki inç kaldırın ve tabağı bu yükseklikten düşürmeye yaklaşık olarak eşdeğer bir kuvvet kullanarak sıkıca aşağı indirin.

Haznenin plastik tarafına yavaşça pipetleyerek ortamı yavaşça hazneye geri ekleyin. Hücreleri rahatsız etmeden yüzen boncukları aspire edin. Tüm boncuk yükleme prosedürü nispeten hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir, böylece hücreler besiyeri olmadığında kurumazlar. Ardından, hücreleri inkübatörde 0,5 ila 2 saat inkübe edin.