JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:11 dk. • July 8th, 2025
Rekombinant adeno-ilişkili virüs, rAAV, belirli bir hücre tipini hedeflemek ve genetik yükünü gen ekspresyonu için konak hücre çekirdeğine taşımak için genetik olarak tasarlanmış küçük, tek sarmallı bir DNA virüsüdür.
Kriyo anestezi uygulanmış bir fare yavrusunu kısıtlayarak başlayın. Sırt cildini sterilize edin ve istenen transgeni kardiyak spesifik bir promotör boyunca taşıyan rAAV vektörünü deri altına enjekte edin. Vektör vasküler sistem tarafından emilir ve kalp de dahil olmak üzere uzak organlara ulaşır.
Burada, rekombinant virüs kardiyomiyositin yüzeyine yapışır ve endositoz yoluyla bir endozoma içselleştirilir. Endozom içinde, viral kapsid kısmen parçalanır ve viral litik proteinleri açığa çıkarır. Bu protein, vektörün sitoplazmaya kaçtığı endozomal zarda gözeneklere neden olur.
Vektör sitoplazmik mikrotübüller boyunca hareket eder ve nükleer gözenekten girer. Çekirdeğe girdikten sonra, viral kapsid genomunu serbest bırakmak için parçalarına ayrılır. Hedef geni taşıyan tek sarmallı DNA daha sonra çift sarmallı DNA'ya dönüştürülür.
DNA transkripsiyonunu takiben, üretilen mRNA sitoplazmaya hareket eder. Burada mRNA, kardiyomiyositlerdeki hedef proteini eksprese eden translasyona uğrar. Kalbe gen iletiminin verimliliğini ve doku özgüllüğünü belirlemek için floresan mikroskobu altında farklı organlardan alınan doku örneklerini gözlemleyin.
Viral titreyi metin protokolüne göre belirledikten sonra, mililitre başına 1-7 x 1012 parçacıklı virüs titreleri ile rAAV9 çalışma solüsyonları hazırlayın. Yenidoğan fareleri tedavi etmek için, 0.33 x 12.7 mililitrelik bir insülin şırıngasını 29 gauge 1/2 inçlik bir iğne ile önceden doldurmak için rAAV9 solüsyonunu kullanın ve hava kabarcıklarını önleyin.
Bir yavruyu kriyoanestezi uyguladıktan sonra, yavruyu bir elinizle başparmağınız ve işaret parmağınızla tutun. Ardından, %70 izopropil alkole doyurulmuş bir çubukla yavrunun arka derisini kaydırın. Şırınga iğnesini, 50 ila 70 mikrolitre rAAV9 çözeltisi enjekte etmeden önce hayvanın ön-dorsal subkutisine 5 ila 10 derecelik bir açıyla yerleştirin.