JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:12 dk. • July 8th, 2025
Ekzojen DNA'yı Anofel embriyosuna mikroenjekte etmek için, istenen sayıda taze hasat edilmiş, blastoderm öncesi, sivrisinek yumurtası alın. Bu erken gelişim aşamasında, yumurta hücresel yapılar oluşturmadan çekirdekler içerir.
Tekne şeklindeki yumurtaları, bir cam kaydırağın yüzeyinde bulunan nemli bir kurutma kağıdının çevresine yerleştirin. Bu adım, sonraki adımlarda enjeksiyon kolaylığı için embriyonun yeterli hidrasyonunu sağlar. Yumurtaları, ventral yüzeyleri dışa bakacak şekilde birbirine bitişik olarak hizalayın.
Şimdi, istenen plazmit çözeltisini içeren dar delikli bir mikroenjeksiyon iğnesi alın. İğneyi yumurtanın arka kutbunun yakınına yerleştirmek için bir diseksiyon mikroskobu kullanın - germ hücresi öncüleri için bir alan. İğneyi, ekzokoryonu - dış tabakayı - ve endokoryonu - yumurta kabuğunun bir iç tabakası - deleceği ve sonunda embriyoya ulaşacağı uygun bir açıyla yerleştirin.
Plazmit karışımını embriyonun sarısına enjekte edin. İğneyi nazikçe geri çekin ve yumurtaların uygun koşullar altında büyümesine izin verin. Yumurta büyüdükçe, bazı çekirdekler arka kutba göç eder ve burada mikroenjekte edilen DNA'yı dahil edebilirler. Bu çekirdekler daha sonra gametler haline gelir - kalıtsal germ hattı mutasyonlarına neden olabilen cinsiyet hücreleri.
Dönüştürülmüş fenotip için yetişkin sivrisinekleri görselleştirin - başarılı mikroenjeksiyonu doğrulayan sonraki nesillerde gözlemlenebilir özellikler.
İğneleri iki mikrolitre DNA karışımıyla doldurmak için bir mikro yükleyici ucu kullanın. İğneyi iğne tutucuya yerleştirin ve otomatik basınç pompası borusunu bağlayın. İğneyi, kızağın düzlemi ile 15 derecelik bir açı yapacak şekilde hizalayın.
İlk yumurtaya dikkatlice dokunarak iğne ucunu açın. Ardından, iğnenin ucunu arka kutupta yaklaşık 10 mikrometreye kadar yerleştirin. Başarılı bir enjeksiyon, yumurta içindeki sitoplazmanın küçük bir hareketine yol açacaktır.
Enjeksiyona devam etmek için bir sonraki yumurtaya geçmek için mikroskop koaksiyel aşama kontrollerini kullanın. İğne ucunun açık kaldığından ve tıkanmadığından emin olmak için, başka bir embriyoya girmeden önce 'Enjekte Et' düğmesine basın ve iğnenin açılışındaki küçük damlacığı görselleştirin. İğne tıkanırsa, iğneyi temizlemek için 'Temizle' düğmesine basın ve damlacık görselleştirme testini tekrarlayın.
Damlacık boyutunun küçük kalmasını sağlamak için iğne ucu açıklığı biraz büyürse basıncı gerektiği gibi ayarlayın. Bir iğne ile yaklaşık 40 ila 50 yumurta enjekte edin. Enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, yumurtaları filtre kağıdı ile kaplı ve 50 mililitre deiyonize su ile doldurulmuş bir cam kapta durulayın.