JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:48 dk. • July 8th, 2025
Hidrodinamik gen transferini gerçekleştirmek için, ilgilenilen geni taşıyan rekombinant plazmitler içeren salin bazlı bir çözelti ile doldurulmuş bir şırınga alarak başlayın. Daha sonra, bir fare modeli alın ve kuyruğun tabanına hızlı bir şekilde büyük miktarda plazmit çözeltisi enjekte edin, böylece plazmit çözeltisinin kuyruk damarına intravenöz olarak enjekte edilmesini sağlayın.
Yüksek hacimli plazmitlerin basınçlı enjeksiyonu, hidrodinamik kuvvet adı verilen mekanik bir kuvvet üretir ve bu da oksijensiz kanı kalbe taşıyan bir damar olan inferior vena kava'daki intravasküler basıncı arttırır.
Büyük sıvı hacmi, kalbin sağ ventrikülünde tıkanıklığa neden olur ve kan yönünde tersine dönmeye zorlar. Bu adım, plazmit çözeltisini karaciğere taşıyan hepatik damara girmeye zorlar.
Plazmitler, hepatik sinüzoidlerin içinde hareket eder - karaciğerde endotel hücreleri tarafından kaplanan boşluklar. Artan kan hacmi, plazmitlerin endotel tabakasına nüfuz etmesine yardımcı olur ve çevredeki hepatositlerin - karaciğer hücrelerinin yakınına ulaşmalarına yardımcı olur.
Plazmit çözeltisinin hızlı akışı, geçici gözenekler oluşturan hepatosit hücre zarı üzerinde baskıya neden olur. Bu gözenekler, hücrelerin plazmit DNA'sını almasını kolaylaştırır. Daha sonra, zar gözenekleri kapanır ve plazmitleri hepatositlerin içinde hapseder.
İlgilenilen genin hepatositlerde başarılı bir şekilde ifade edilmesi, transfeksiyonu doğrular.
Fareleri tartarak başlayın, ardından mililitre salin endotoksin içermeyen uyuyan güzel vektör yapısı başına 15 mikrogram ve mililitre endotoksin içermeyen pc-HSB1 başına 5 mikrogram içeren steril bir tuzlu su çözeltisi hazırlayın. Her fareye vücut ağırlığının% 10'u kadar bir hacim enjekte etmek için yeterli çözelti hazırlayın. Steril bir 3 mililitrelik şırıngayı bir fare için gerekli hacimle doldurun ve 27 gauge bir iğne takın.
Hareket için minimum alan, ancak nefes almak için yeterli alan bırakmak için uygun miktarda kağıt mendil ekledikten sonra, fareyi solunum delikleri olan uygun bir tutucuya yerleştirin. Kuyruğun hızlı hareketi veya diğer ajitasyon belirtileri gibi aşırı ısınma belirtilerini dikkatlice izlerken kızılötesi bir lamba kullanarak kuyruğu 30 ila 60 saniye ısıtın, ardından kuyruğu alkollü bir bezle temizleyin.
İğneyi, kuyruğun tabanına yakın iki yanal kuyruk damarından birine neredeyse yatay olarak sokun. Başarılı bir şekilde yerleştirilirse, iğnenin konisine az miktarda kan geri akabilir. Toplam hacmi 8 ila 10 saniye içinde kuyruk damarına enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, fareyi hemen süzgeçten çıkarın. Enjeksiyon yarasını steril gazlı bezle en az 30 saniye veya herhangi bir kanama azalana kadar sıkıştırın.
Başarılı hidrodinamik kuyruk damar enjeksiyonu, transfeksiyon için çok önemlidir ve özellikle enjeksiyon hızına, hacmine ve süresine bağlıdır. İntravenöz enjeksiyonu kolaylaştırmak için, farelerin enjeksiyon gününde strese girmediğinden veya susuz kalmadığından emin olun.
Bir kurtarma kafesinde 30 ila 60 dakika yalnız kaldıktan sonra, fareyi orijinal kafesine geri aktarın.