Agrobakteri Aracılı Genetik Dönüşüm: Genetik Olarak Tasarlanmış Agrobacterium tumefaciens ile Pirinç Genomunu Genetik Olarak Dönüştürmek İçin Bir Yöntem

Bitki patojenik bir bakteri olan Agrobacterium tumefaciens, transfer DNA'sında veya T-DNA bölgesinde ilgilenilen bir geni taşıyan yapay olarak hazırlanmış bir Ti plazmidi ve T-DNA'yı bitki hücrelerine aktarmak için virülans veya Vir genlerini taşıyan bir yardımcı plazmid eklenerek genetik olarak tasarlanabilir.

Agrobacterium aracılı genetik dönüşüm için, genç bir pirinç salkımı ile başlayın ve küçük parçalar halinde kesin. Kesimleri bir büyüme ortamına aktarın ve kesimlerin kallus adı verilen farklılaşmamış bir hücre kütlesine büyümesini kolaylaştırmak için kuluçkaya yatırın.

Şimdi, kallusu, Agrobacterium için bir kemoatraktan olan asetosiringon içeren bir Agrobacterium infiltrasyon ortamına aktarın. Daha sonra, ortama genetik olarak tasarlanmış bir Agrobacterium kültürü ekleyin ve kısa bir süre inkübe edin.

Asetosiringon molekülleri, Agrobacterium zarı üzerindeki hücre reseptör proteinini - VirA - aktive eder ve bu da bir transkripsiyonel aktivatör proteini olan VirG'nin fosforilasyonuna daha fazla aracılık eder. Fosforile VirG, yardımcı plazmide doğru hareket eder ve kanal proteinleri ve endonükleazlar - VirD1 ve VirD2 dahil olmak üzere bir dizi virülans geninin transkripsiyonunu aktive eder.

Kanal proteinleri, bakteri ve bitki hücresini birbirine bağlayan bir taşıma kanalı oluştururken, endonükleazlar Ti plazmidindeki sınır dizilerine bağlanır ve T-DNA'yı bir ucundan bağlı olan VirD2 ile parçalar. Daha sonra VirD2, T-DNA'nın taşıma kanalı yoluyla kallus hücrelerine girişini yönlendirir ve pirinç genomuna entegrasyonunu kolaylaştırır.

Her çiçeklenmeyi% 70 alkollü bir bezle silin ve kesmeden önce kurumasını bekleyin. Çiçeklenmeyi steril bir laboratuvar tezgahına getirin ve sterilize edilmiş makasla küçük parçalar halinde kesin. Ardından, kesimleri NBD2 ortamı içeren bir Petri plakasına aktarın.

Plakayı karanlıkta 26 santigrat derecede, nasırı indüklemek için 10 ila 14 gün boyunca inkübe edin. Dönüşümü gerçekleştirmek için, seçici antibiyotikli YEB plakasından tek bir koloniyi, 50 mililitrelik konik steril bir test tüpünde aynı antibiyotikleri içeren 5 mililitre sıvı YEB ortamına aktarın. Tüpü 250 x g ve 25 ila 28 derece Santigrat derecede, bakteriler 0.5 OD_600'e ulaşana kadar

250 mililitrelik konik bir şişede, aynı seçici antibiyotiklerle 100 mililitre YEB ortamına 1 mililitre bakteri süspansiyonu ekleyin ve şişeyi 250 x g'da ve dört saat boyunca 28 santigrat derecede bir orbital çalkalayıcı üzerinde sallayın. Bakterileri toplamak için kültürü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti AAM-AS ortamı ile yeniden süspanse edin ve süspansiyonu 0.4'ün OD_600'üne seyreltin.

Kuluçkadan sonra, yaklaşık 150 sağlıklı, açık sarı, embriyojenik kalli 150 mililitrelik steril bir şişeye toplayın. Şişeye 50 ila 75 mililitre bakteri hücresi süspansiyonu ekleyin ve ardından kallileri ara sıra çalkalayarak 10 ila 20 dakika daldırmak için 10 ila 25 mililitre taze AAM-AS ortamı ekleyin.

Bakteri süspansiyonunu şişeden dikkatlice dökün ve kalli'yi steril filtre kağıdı ile kurulayın. Ardından, bunları NBD-AS besiyeri olan bir Petri kabına yerleştirin ve üzerlerini filtre kağıdı ile örtün. Calli'yi karanlıkta 25 ila 28 santigrat derecede üç gün boyunca kuluçkaya yatırın ve bakteri üremesini kontrol edin.

Üç günlük birlikte yetiştirmeden sonra, calli'yi filtre kağıdı kullanarak steril bir Petri kabına aktarın, ardından temiz bir tezgahta iki saat havayla kurutun. Kali'nin filtre kağıdına yapışmadığından emin olun ve bunları birincil seçim ortamı NBD2'ye aktarın.

İki hafta sonra, kalli'yi taze seçim ortamı içeren yeni bir tabağa eşit şekilde aktarın. Daha sonra, farklılaşma için kallileri taze MS ortamına ve daha fazla sürgün çoğaltmak için sürgün tomurcuklarını MS ortamına (10 mg / L Higromisin ile) taşıyın.