JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 3:59 dk • July 8th, 2025
Primer nöronal hücrelere elektroporasyon bazlı plazmit DNA iletimi için, uygun elektroporasyon ortamında hücrelerin askıya alınmasıyla başlayın. Elektroporasyon karışımını hazırlamak için floresan protein kodlayan plazmit DNA'sını ekleyin.
Elektroporasyon karışımını nazikçe bir elektroporasyon küvetine aktarın ve elektroporasyon verimliliğini olumsuz etkileyebilecek hava kabarcıklarından kaçının. Küveti elektroporatörün küvet tutucusuna aktarın; Elektroporasyon parametrelerini ayarlayın. Elektroporasyonu başlatın.
Hücre zarı boyunca uygulanan yüksek voltajlı kısa elektrik darbeleri, zarın her iki tarafında diferansiyel yük birikimine neden olarak, transmembran potansiyelini, hücre zarı boyunca voltajı arttırır.
İndüklenen transmembran potansiyeli, lipid çift tabaka parçalanma potansiyelini aştığında, lipid çift tabakası, hücre zarı üzerinde geçici hidrofilik gözenekler oluşturarak lokalize konfigürasyon değişikliği ile kararsızlaşır. Yeterli büyüklükteki gözenekler, plazmit DNA'nın hücre sitoplazmasına girmesi için bir yol sağlar.
Elektroporasyonun tamamlanmasının ardından, lipid çift tabakası yeniden kapanır, hücre zarı çift tabaka bütünlüğünü geri kazandırır, böylece plazmit DNA'yı hapseder. Ayrıca, hücre döngüsü fazı sırasında, çekirdek zarı, çekirdeği çevreleyen çift katmanlı zar parçalarına ayrıldığında, plazmit DNA çekirdeğe yer değiştirir.
Plaka elektroporasyonlu hücreleri, protein kaplı lameller ile çok kuyulu bir plakanın ortam içeren kuyucuklarına yerleştirin. Hücrelerin protein kaplı lamel üzerine yapışmasına izin vermek için inkübe edin. Plazmit DNA içeren başarılı bir şekilde transfekte edilmiş hücreler, floresan proteinleri eksprese eder.
Başlamak için, kaplanmış lameller içeren 24 oyuklu kültür plakasının her bir duvarına 0,5 mililitre kültür ortamı ekleyin ve bir karbondioksit inkübatörde 37 santigrat derecede sıcak tutun. Gerekli sayıda hücreyi steril 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da döndürün.
Süpernatanı atın ve hücre peletini 200 mikrolitre Opti-MEM içinde yeniden süspanse edin. Tüpte artık kültür ortamı bulunmadığından emin olmak için bu prosedürü iki kez tekrarlayın. Elektroporasyon parametrelerini listelendiği gibi ayarlayın. İyice karıştırmak için elektroporasyon reaksiyonunu nazikçe pipetleyin ve karışımın tam hacmini 200 mikrolitre cinsinden iki milimetre aralıklı küvete aktarmak için uzun bir P100 pipet ucu kullanın.
Küvet küvet haznesinin içine girdikten sonra, elektroporatörün omega düğmesine basın ve 100 mikrolitrelik kesin bir hacme bağlı kalarak empedans değerini not edin. Empedans değerlerinin aralığı yaklaşık 30 ve 35 olmalıdır.
Nabzı başlatmak için Başlat düğmesine basın. Okuma çerçevesinde gösterilen ölçülen akım değerlerini ve mücevherleri kaydedin. Küveti hazneden çıkarın.
Hemen küvete 100 mikrolitre önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin ve iki ila üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu hemen önceden hazırlanmış olan 24 oyuklu plakaya aktarın. Hücreleri bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin.