Parazit Formlarının Nükleofeksiyonu: Floresan Protein Kodlayan Plazmitleri Sporozoit Çekirdeğine Vermek için Elektroporasyon Tabanlı Bir Transfeksiyon Yöntemi

0 görüntüleme3:23 dk • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazmitleri nükleofeksiyon yoluyla sporozoit çekirdeklerine iletmek için, tampon içinde izole, canlı sporozoitlerin - parazitlerin hareketli, enfeksiyöz aşaması - süspansiyonu ile başlayın. Sporozoitler, bir dış plazma zarı ve yapısal stabilite ve hareketlilik için kritik olan bir dizi düzleştirilmiş vezikül ve proteinden oluşan altta yatan bir iç zar kompleksi ile çevrili ince şekilli hücrelerdir.

Sporozoitleri peletlemek için süspansiyonu santrifüjleyin. Sporozoit peletini, floresan protein kodlayan plazmitlerle desteklenmiş uygun bir hacimde nükleer transfeksiyon tamponu içinde yeniden süspanse edin. Yüksek tamponlama kapasitesine ve iyonik kuvvete sahip nükleer transfeksiyon tamponu, sporozoit işlevselliğini korurken verimli transfeksiyon sağlar.

Süspansiyonu bir nükleer transfeksiyon küvetine aktarın. Küveti bir nükleofeksiyon cihazının tutucusuna yerleştirin. Uygun nükleofeksiyon programını çalıştırın.

Çekirdeklenme sırasında, özel olarak uygulanan, kısa, yüksek voltajlı darbeler, tampon bileşenleri ile birlikte, plazma zarını ve iç zar kompleksini geçici olarak bozarak, plazmitlerin sitoplazmaya erişimini sağlayan transmembran gözenekleri oluşturur.

Aynı zamanda, bu yüksek mukavemetli elektrik alanları, geçici boşluklar geliştiren çekirdeği çevreleyen çift katmanlı nükleer zarı da bozar ve hücre bölünmesine gerek kalmadan plazmitlerin çekirdeğe doğrudan girişini kolaylaştırır.

Nükleofeksiyon tamamlandıktan sonra, hücresel ve nükleer zar gözenekleri yeniden kapanır, plazmitleri çekirdeğin içinde hapsederken zar bütünlüğünü ve homeostazı geri kazandırır.

Küveti cihazdan çıkarın. Sporozoit geri kazanımı için uygun ortam ekleyin ve yeni bir tüpe aktarın. Plazmid DNA ile başarılı bir şekilde nükleofede edilmiş sporozoitler, floresan proteinleri eksprese eder.

İlk olarak, sporozoitleri veya merozoit süspansiyonunu 10 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin, ardından süpernatanı atın. Aşağıdaki sırayla, sporozoitler veya merozoitler içeren 1.5 mililitrelik tüpe 85 mikrolitre nükleer transfeksiyon tamponu, 10 mikrogram plazmit ve 25 birim kısıtlama enzimi ekleyin. Süspansiyonu bir nükleer transfeksiyon kabına aktarın.

Kabı bir nükleer transfer oluğuna koyun, güç düğmesini kullanarak nükleofeksiyon cihazını açın ve U-033 transfeksiyon prosedürünü seçin. Program bittiğinde, nükleofeksiyon cihazının X düğmesine basın ve ekranda OK görüntülenerek nükleofeksiyonun başarılı olduğunu gösterir. Reaksiyonu durdurmak için nükleofeksiyon kabına 0,5 ila 1 mililitre Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'unu ekleyin.

Yavaşça karıştırdıktan sonra, süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

12:58

Lusiferaz haberci geni ile RAW264.7 hücreleri transfekte

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:45

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

13:27

Akustik Nanodispensing teknolojisini kullanarak yüksek verim DNA Plasmid multiplexing ve transfeksiyon

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:55

Floresan Biyomoleküllerin Bakteriyel Hücrelere Elektroporasyon Tabanlı Teslimatı

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:59

Elektroporasyon Aracılı İn Vitro Gen İletimi: Floresan Raportör Protein Kodlayan Plazmitleri Kültürlenmiş Hücrelere Sokmak İçin Bir Elektrik Darbe Tekniği

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:52

Genetik Manipülasyon Δku80 Suşlarının Toxoplasma gondii

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:25

CRISPR/Cas9 gen düzenleme yapmak koşullu mutantlar, insan sıtma parazit P. falciparum için

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:51

Kültür ve zebra balığı primer hücre Transfection

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:02

Yetişkin Zebrafish Telencephalon Plazmid DNA In Vivo Teslim için Elektroporasyon Yöntemi

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:26

Tavuk Eimeria Parazitlerinin Nükleofeksiyon uyup In Vivo Propagation

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 1 Ağustos 2026