JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:31 dk. • July 8th, 2025
Lazer destekli lentiviral gen iletimi, bir transgeni bir konakçı sisteme aktarmak için kullanılan bir tekniktir.
Transgenik fareler üretmek için, uygun bir kültür ortamında izole edilmiş fare döllenmiş yumurtaları ile başlayın. Döllenmiş yumurta içeren kültür kabını, bir lazer aparatı ile önceden kurulmuş ve bir kontrol yazılımına bağlı bir mikroskop aşamasına yerleştirin. Uygun büyütme oranında gözlemleyin.
Döllenmiş yumurtalar, lentiviral partikülleri engelleyen koruyucu bir glikoprotein tabakası olan zona pellucida ile çevrilidir. Bu bariyeri nüfuz etmek için lazer cihazını açın ve lazer LED'inin zona pellucida üzerinde görünür olduğundan emin olun. Kontrol yazılımını kullanarak lazeri ateşleyin. Ateşleme süresini istenen perforasyon çapına göre ayarlayın.
Yumurtaları kurtarma için bir kuluçka makinesine yerleştirin. Kısa bir inkübasyondan sonra, yumurtaları çıkarın ve ilgilenilen geni taşıyan lentivirüs parçacıkları ve floresan seçilebilir bir işaretleyici ekleyin.
Zona pellucida delikli olduğunda, lentivirüs yumurta hücresi zarına doğru kolayca yayılır ve endositoz yoluyla girer. Lentivirüs parçalarına ayrılır ve RNA'sını serbest bırakır, bu da sırayla çift sarmallı bir DNA'ya işlendiğinde, konakçı çekirdeğe girer ve yabancı genleri konakçı genomuna entegre eder.
Yumurtaları kuluçkaya yatırın ve blastosistlere dönüşmelerine izin verin. Blastosistleri çiftleşmiş dişi farelere implante edin. Gebelik tamamlandıktan sonra, yavruları kurtarın ve transgen varlığı açısından analiz edin.
Yumurtalar kuluçka makinesindeyken, XYClone lazeri üreticinin tavsiyelerine göre kurun ve kalibre edin. Yumurtalar hazır olduğunda, ilk damla plakasını lazer mikroskobu aşamasına yerleştirin ve zona pellucida'yı manuel olarak odaklayın. Lazer LED ışığının objektiften görünür olduğunu onayladıktan sonra, LED lazerle bölgeyi hedeflemek için mikroskop aşamasını hareket ettirin ve XYClone lazeri 250 mikrosaniyeye ayarlamak için bilgisayar yazılımını kullanın.
LED ışık boyutunu uygun boyutlara ayarlayın ve üç adet 10 mikrometrelik delik oluşturmak için her yumurtanın zona pellucida'sını lazerle üç kez delin.
Döllenmiş yumurtalar kuluçka makinesinin dışında 15 dakikadan daha uzun süre kalamayacağı için perforasyonun hızlı ama dikkatli bir şekilde yapılması çok önemlidir.
Ardından, delikli yumurtaları iki saat daha kuluçka makinesine geri koyun. İkinci inkübasyonun sonunda, 50 mikrolitrelik KSOM damlasını 2 mikrolitre konsantre lentivirüs ile karıştırmadan tedavi edin ve yumurtaları dört gün boyunca inkübatöre geri koyun. Yumurtalar blastosistlere dönüştüğünde, yaklaşık 10 ila 15 embriyoyu ve yaklaşık 2 mikrolitre KSOM'yi biriktirmek için cerrahi olmayan bir embriyo transfer cihazı kullanın.
Embriyo transferinden 17 gün sonra, hamile farenin doğal olarak doğum yapmasına izin verin veya gerektiğinde yenidoğanları sezaryen ile toplayın.