JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 5:33 dk. • July 8th, 2025
Bir mikrosantrifüj tüpünde optimum hacimde altın boncuklarla - biyolojik olarak inert ve toksik olmayan gen dağıtım araçları - ile başlayın. Daha sonra, katyonik ajanlar ekleyin - spermidin ve kalsiyum klorür, ardından altın boncuklara istenen DNA parçaları gelir. Tüpü nazikçe hafifçe vurun ve inkübe edin.
Kalsiyum klorür, DNA fragmanlarına bağlanır ve spermidin kalıntıları yoluyla altın boncuklar üzerine kaplanmasını kolaylaştırır. Ardından, çözücüyü santrifüjleyin ve çıkarın. DNA kaplı boncukları etanol içinde yeniden süspanse edin. Boncukları steril bir makro taşıyıcı diske nazikçe pipetleyin. Kurumasını bekleyin.
Bir helyum gazı hızlandırma tüpü ve bir yırtılma diski ve ilgili yuvalarında bir durdurma ekranı bulunan bir bombardıman odası içeren bir biyolistik gen tabancası cihazı kurun. Ardından, makro taşıyıcı diski ters çevirin ve yırtılma diskinin altına yükleyin.
Daha sonra, kültürlenmiş hedef konakçı hücreleri, dönüşüm verimliliğini artırmak için ozmotik bir stabilizatör olan sorbitol ile desteklenmiş uygun bir katı ortama yerleştirin. Kurulum hazır olduğunda, gen tabancasını ateşleyin.
Helyum hızlanma tüpünden aşağı doğru hareket ederken, yırtılma diski kırılana kadar basınç oluşmaya devam eder ve helyum şok dalgaları oluşturur. Bu şok dalgaları, altın boncukları taşıyan makro taşıyıcı diski, yalnızca altın boncukların geçmesine izin veren durdurma ekranına doğru hareket ettirir.
Hızlandırılmış altın boncuklar, konak hücre çekirdeğine nüfuz ederek istenen DNA'yı konak hücre genomuna entegre eder.
Turuncu makro taşıyıcı biyolistik diskleri %100 etanole batırmak için forseps kullanarak başlayın, ardından disklerin kurutucuya temas etmemesine dikkat ederek diskleri drierit içeren büyük bir Petri kabına aktarın. Kuruduktan sonra, diskleri etanolle silinmiş gümüş disk tutuculara bastırın, ardından bir tüp altın boncuk girdaplayın ve boncuk çözeltisinin 12 mikrolitresini dönüşüm başına 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne alın.
Daha sonra, her bir boncuk tüpüne sırayla 2 mikrogram DNA, 10 mikrolitre kalsiyum klorür ve iki mikrolitre spermidin içermeyen baz ekleyin. Daha sonra her bir numuneyi girdaplayın, tüpleri ortam sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve çökelmiş boncukları yeniden süspanse etmek için ara sıra hafifçe hafifçe vurun.
Kuluçka işleminin sonunda, DNA kaplı altın boncukları peletleyin ve süpernatanı dikkatlice aspire edin. Boncukları 600 mikrolitre% 100 etanol içinde yavaşça tamamen yeniden süspanse edin, ardından hücreleri tekrar pelet haline getirin, bu sefer boncukları 8 mikrolitre etanol içinde yeniden süspanse edin.
Şimdi her bir boncuk tüpünü 1 santimetre çapında daireler halinde ayrı bir biyolistik diskin merkezine dağıtın. Yeterli konsantrasyonda boncuk mevcutsa, boncuklar kuruduktan sonra her diskin ortasında altın bir daire görünecektir.
Gen tabancasını çalıştırmak için önce vakum pompasını açın, ardından manometrede yaklaşık 2200 PSI'lik bir basınca ulaşılana kadar helyum tankı düğmesini saat yönünün tersine çevirin. Ardından, gen tabancasını açmak için sol kırmızı anahtarı çevirin ve vakum ve havalandırma deliği için akış hızlarını, vakum 15 saniye içinde 28 inç cıvaya ulaşacak şekilde ayarlayın. Yırtılma diski ile makro taşıyıcı arasındaki mesafenin de şu anda bir inçin yaklaşık 3/8'i olduğunu onaylayın.
Her şey yerine oturduğunda, tüm hazneyi %70 etanol ile silin ve yırtılma disklerini %100 etanole batırın. Diskleri steril bir yüzeyde kuruttuktan sonra, yırtılma diski tutucusunu gevşetmek için bir tork anahtarı kullanın ve temiz bir disk yerleştirin. Yırtılma diski tutucusunu tekrar yerine vidalayın ve sıkmak için tork anahtarıyla bir kez sağa çevirin.
Ardından, örgü ekranları %100 etanole batırın. Kuruduktan sonra, beyaz plastik montaj plakasına bir ekran yerleştirin ve makro taşıyıcı disk tutucuyu DNA tarafı aşağı bakacak şekilde disk bölmesine yerleştirin. Gümüş kapağı vidalayın ve montaj plakasını en yüksek yuvaya yerleştirin, ardından alt plakaya 1 molar sorbitol içeren bir YPD agar plakası yerleştirin.
Şimdi hazne kapısını kapatın ve yerine kilitleyin, ardından vakumu devreye sokmak ve 28 inç cıvaya ulaşmasını sağlamak için ortadaki kırmızı anahtarı yukarı konumda itin ve basılı tutun. Uygun vakum seviyesine ulaşıldığında ve ortadaki anahtar aşağı konuma getirildiğinde, ateşlemek için sağ kırmızı anahtarı basılı tutun.
Yırtılma diski patladığında, hemen ateşleme düğmesini bırakın ve hazneyi 0 PSI'ye çıkarmak için ortadaki kırmızı anahtarı orta konuma itin. Atış başarılı olduysa, plaka üzerinde altın bir yüzük görünecektir. Yırtılma diskini ve makro taşıyıcı disk kalıntılarını temizleyin ve gen tabancasını kapatın, ardından gazı kapatmak ve vakum pompasını kapatmak için helyum tankı düğmesini saat yönünde çevirin.