JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 3:02 dk • July 8th, 2025
Retroviral vektörler içeren RNA ile konak hücreleri dönüştürmek için, uygun ortamda paketlenmiş vektörler içeren bir tüp alın. Her vektör, konakçı genomuna entegre edilecek transgenin RNA tamamlayıcısını ve önemli viral enzimleri içeren bir viral kapsid içerir. Bir lipid çift tabakası, konakçı hücreye girişi kolaylaştırmak için kapsidi çevreler.
Vektörleri, uygun bir transfeksiyon reaktifi varlığında, konak hücre süspansiyonunu içeren bir kültür plakasının kuyucuğuna ekleyin. Plakayı örtün. Spin iletimine izin vermek için düşük hızda santrifüjleyin. Bu, viral vektörü konak hücre yüzeyine yaklaştırır ve transdüksiyon verimliliğini artırır.
Eşzamanlı olarak, transfeksiyon reaktifindeki polikatyonlar, virüs ve konakçı hücre üzerindeki negatif yükleri nötralize ederek hedef hücrelere viral adsorpsiyonu teşvik eder.
Sonuç olarak, virüs yüzeyindeki reseptörler, konak zarı ile füzyonunu kolaylaştırır. Viral kapsid hücreye girer ve yırtılır, transgenik RNA ve viral enzimleri sitoplazmasına bırakır.
Sitoplazmanın içinde, viral ters transkriptaz, RNA'yı tek sarmallı bir tamamlayıcı DNA'ya dönüştürür ve daha sonra onu çift sarmallı proviral DNA'ya dönüştürür. Ortaya çıkan DNA çekirdeğe girer. Viral integraz enzimi, proviral DNA'nın konakçı genomuna entegrasyonuna aracılık eder ve bu da transdüksiyonlu hücrelerle sonuçlanır.
Viral üretici hücre hattından taze viral süpernatan toplayın. Bu noktada, hücreler tanımlanmış bir morfoloji ile iyi aralıklı olmalıdır. Daha sonra, kemik iliği hücrelerini içeren 6 oyuklu plakanın her bir oyuğundan en üstteki 2 mililitre ortamı dikkatlice aspire edin. Genellikle kuyu ortasında yoğunlaşan kemik iliği hücrelerini aspire etmekten kaçının.
Kemik iliği hücreleri içeren 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 3 mililitre taze takviye edilmiş viral süpernatan ekleyin. Plakaları plastiğe sardıktan sonra, sıkma transdüksiyonunu tekrarlayın ve ardından sarılmamış plakaları doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Üçüncü günde 24 saat sonra, kuyucuklardan 2 mililitre ortamı çıkarın ve değiştirin.