JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:10 dk. • July 8th, 2025
Vasküler düz kas hücreleri veya VSMC'ler, kan damarı duvarının orta tabakası olan tunika ortamındaki belirgin hücresel bileşenlerdir. Patolojik ipuçlarına veya yaşlanmaya yanıt olarak, bu hücreler vasküler kalsifikasyona aracılık eder - hücre dışı matriste kalsiyum birikimi olgusu.
Önceden kalsifiye edilmiş, murin aort VSMC kültürünün yapışkan bir tabakası içeren çok kuyulu bir plaka alın. Hücresel proteinleri çapraz bağlamak için hücreleri formalin çözeltisi ile inkübe edin ve boyamadan önce VSMC yapısını stabilize edin.
Kuyudan formalini aspire ederek ve gümüş nitrat çözeltisi ekleyerek von Kossa boyamaya başlayın. Plakayı uygun bir ışık kaynağı altında inkübe edin.
Gümüş nitrat çözeltisi, VSMC tabakasının hücre dışı matrisindeki kalsifikasyon bölgelerine ulaştığında, gümüş iyonları fosfata bağlı kalsiyum iyonlarının yerini alır. Bu, geçici bir sarı renklenmeye neden olur. Organik madde ve ışığın varlığında, gümüş fosfatın fotokimyasal bozunması, siyah renkli metalik gümüş oluşumuna neden olur.
Maksimum harcanan gümüş nitrat çözeltisi miktarını atın. Hücreleri sodyum tiyosülfat çözeltisi ile tedavi edin. Bu çözelti, artık gümüş tuzlarını suda çözünür bir komplekse dönüştürür ve bu kompleks, suyla son bir durulama yoluyla çıkarılabilir ve lekelenme kontrastını iyileştirir.
Kalsifikasyonu gösteren çözünmeyen siyah birikintileri bulmak için lekeli hücreleri görüntüleyin.
Vasküler düz kas hücrelerinde kalsifikasyonu indüklemek için, hücreleri altı kuyulu kültür plakasına aktarın ve yapışmalarına izin verin. Daha sonra, hücreleri kalsifikasyon ortamında yeniden besleyin. Hücreleri en az yedi gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, ortamı hücre kültürü plakasından aspire edin. Hücreleri bir kez deiyonize suda yıkayın.
Hücreleri, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1 mililitre% 10 formalin içine yerleştirerek sabitleyin. Daha sonra formalini çıkarın ve sabit hücreleri 5 dakika boyunca damıtılmış suyla yıkayın.
Daha sonra, hücreleri 1 ila 2 saat boyunca 60 ila 100 watt'lık bir ampul altında 1 mililitre% 5 gümüş nitrat çözeltisi içinde inkübe edin. Daha sonra gümüş nitrat çözeltisini aspire edin ve 5 dakika boyunca damıtılmış su ile yıkayın. 5 dakika sonra, hücreleri 5 dakika boyunca damıtılmış suda 1 mililitre% 5 sodyum tiyosülfat çözeltisine yerleştirerek reaksiyona girmemiş gümüşü çıkarın. Daha sonra, hücreleri 5 dakika boyunca damıtılmış suyla durulayın. Von Kossa ile boyanan hücreler artık standart ters çevrilmiş ışık mikroskobu ile görüntülemeye hazırdır.