JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 3:14 dk • July 8th, 2025
Yumuşak doku mikro ortamlarında hücre sitoplazmasına özgü boyama için, yeni hasat edilmiş bir fare böbreği elde edin. Formaldehit, buzlu asetik asit ve metanol içeren fiksatif bir çözelti ile muamele edin. Düşük sıcaklıklarda inkübe edin.
Formaldehit hücrelere nüfuz eder, proteinleri proteinlere ve proteinleri nükleik asitlere çapraz bağlar. Metanol, dokudaki suyun yerini alır ve proteinleri pıhtılaştırır. Asetik asit, hücre içi asitleşmeye ve doku şişmesine neden olur, böylece metanolün neden olduğu doku büzülmesine karşı koyar.
Fiksasyon, enzimleri inaktive eder ve sonraki boyama için doku morfolojisini stabilize eder. Tampon kullanarak fazla fiksatifleri çıkarın. Dokuyu asidik bir boya olan eozin Y ile inkübe edin.
Eozin sabit hücrelere nüfuz eder ve sitoplazmaya girer. Asetik asit muamelesinden sitoplazmanın asidik ortamı, sitoplazmik proteinlerin amino gruplarının maksimum protonasyonuna neden olur.
Negatif yüklü fonksiyonel gruplara sahip eozin, protonlanmış protein grupları ile elektrostatik olarak etkileşime girerek kararlı bir boya-protein kompleksi oluşturur ve birikme üzerine sitoplazmayı pembeye boyar. İnkübasyon sonrası, lekeli böbreği küçük parçalara ayırın, ardından artan etanol konsantrasyonlarında doku dehidrasyonu yapın.
Böbrek dokusunu parafin mumuna gömün. Bir mikrotom kullanarak ince doku kesitleri elde edin. Ayrıca, mikroskobik analiz için bölümleri yeniden sulandırın.
Boyanmamış hücre çekirdekleri, pembe lekeli bir sitoplazmaya karşı beyaz görünür ve fırça kenarları olmayan düzleştirilmiş epitel hücreleri ile kaplı proksimal kıvrımlı tübüller veya toplayıcı kanallar içeren proksimal kıvrımlı tübüller gibi böbrek mikro yapılarının görselleştirilmesini sağlar.
Yumuşak doku örneklerini sabitleyerek başlayın. 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünü 9.5 mililitre% 4 formaldehit ve 0.5 mililitre buzlu asetik asit içeren fiksatif bir çözelti ile doldurun. Yumuşak doku örneğini santrifüj tüpüne ekleyin ve 24 ila 72 saat buzdolabında saklayın.
Soğutmadan sonra, yumuşak doku örneğini 1 saat boyunca DPBS solüsyonu ile yıkayın. Daha sonra, numuneyi 2 mililitre eozin Y-boyama solüsyonuna koyarak boyayın ve 24 saat boyunca yatay bir çalkalama plakası üzerinde inkübe edin.
Ertesi gün, yumuşak doku örneğini numune kabından dikkatlice çıkarın ve fazla boyama maddesini selüloz kağıt mendil ile çıkarın. Depolama ve daha fazla kullanım için etanol buhar fazının üzerinde konik bir kaba koyun.