JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 4:33 dk. • July 8th, 2025
Kanser metastazı sırasında, birincil bir tümörden gelen tümör hücreleri dolaşım sistemi boyunca hareket eder, uzak organlara ekstravaze olur ve ikincil tümörler oluşturur.
4T1 hücreleri, yüksek metastatik meme kanseri hücreleri enjekte edilmiş bir meme kanseri fare modelinde akciğer metastazını değerlendirmek için, hasat edilen akciğerlerden izole edilen 4T1 hücrelerini içeren bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Süspansiyonu santrifüjleyin ve hücreleri 6-tiyoguanin, 6-TG - bir guanin analoğu içeren ortamda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu bir kültür plakasına tohumlayın.
6TG, spesifik transferaz enziminin onu toksik bir nükleotit olan 6-TG nükleotidine dönüştürdüğü normal hücrelere girer. Bu sitotoksik nükleotidler DNA'ya dahil edilerek DNA hasarına neden olur ve hücreleri kültürden seçici olarak elimine eder. 4T1 hücreleri, toksik nükleotidler oluşturma yeteneğini azalttı, bu da hayatta kalmalarını ve plakaya yapışmalarını kolaylaştırdı. Hücrelerin çoğalma yeteneğine bağlı olarak koloniler oluştururlar.
Hücreleri metanol ile tedavi edin. Metanol hücrelere nüfuz eder ve hücresel proteinleri denatüre eder. Hücreleri metilen mavisi ile inkübe edin.
Pozitif yüklü boya hücreye girer, negatif yüklü DNA ile etkileşime girer ve DNA ipliklerinin bitişik baz çiftleri arasındaki boşluklara girer. Aynı zamanda sitoplazmadaki RNA'ya bağlanır, ancak daha düşük afiniteye sahiptir. Çekirdekler, düşük RNA konsantrasyonu nedeniyle sitoplazmadan daha yüksek DNA konsantrasyonu nedeniyle koyu mavi renkte boyanır. Metastatik koloniler mavi noktalar olarak görünür.
Plakayı görüntüleyin. Fare akciğerlerindeki metastatik yükü ölçerek metastatik kolonileri belirlemek için yazılım kullanın.
1X HBSS ile tüpün hacmini 10 mililitreye getirin. Ardından, içeriği 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinin üzerine 50 mililitrelik konik tüpe dökün. Numuneyi süzgeçten nazikçe öğütmek için 1 mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanın.
Tüpü 350 kez g'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Ardından peleti 10 mililitre 1X HBSS ile iki kez yıkayın. Peletleri 10 mililitre 60 mikro azı dişi 6-Tiyoguanin tam kültür ortamında yeniden süspanse edin ve istenirse numuneleri bir seyreltme şeması kullanarak 10 santimetrelik hücre kültürü plakalarına yerleştirin.
Plakaları 5 gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Kültür ortamını plakalardan uygun atık kabına dökün. Hücreleri sabitlemek için, her plakaya 5 mililitre seyreltilmemiş metanol ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin, metanolü tüm plakayı kaplayacak şekilde döndürdüğünüzden emin olun.
Metanolü plakalardan uygun atık kabına dökün, ardından her plakayı 5 mililitre damıtılmış su ile durulayın. Plaka başına 5 mililitre %0.03 metilen mavisi ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin, metilen mavisi solüsyonunu tüm plakayı kaplayacak şekilde döndürdüğünüzden emin olun. Metilen mavisini uygun atık kabına dökün ve her plakayı 5 mililitre damıtılmış su ile tekrar durulayın.
Plakayı ters çevirin ve fazla sıvıyı çıkarmak için bir kağıt havluya kurulayın. Plakayı kapağına yerleştirin ve gece boyunca kurumaya bırakın. Metastatik koloniler mavi olacaktır. Plakalar kuruduktan sonra süresiz olarak oda sıcaklığında saklanabilirler.