Hücrelerin Periyodik Asit-Schiff Boyama: Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinde Glikojen Düzeylerini Tespit Etmek İçin İn Vitro Bir Teknik

Periferik kan mononükleer hücreleri veya PBMC'ler, B ve T lenfositleri, doğal öldürücü hücreler, monositler ve dendritik hücrelerden oluşan tek, büyük çekirdekli dolaşım kan hücreleridir. PBMC'ler, fazla glikozu sitoplazmalarında glikojen - dallı bir polisakkarit - olarak polimerik formda depolar.

PBMC'lerde glikojen varlığını tespit etmek için, bir cam slayt üzerinde izole edilmiş PBMC'lerin tek tip bir yaymasını hazırlayın. Hücreleri, hücresel biyomolekülleri çapraz bağlayan ve PBMC'lerin yapısal bütünlüğünü koruyan fiksatif bir çözelti olan formalin ile tedavi edin.

Slaytı kısmen amilaz çözeltisine daldırın. Bu enzim hücrelere girer ve tedavi edilen hücrelerde glikojeni hidrolize eder. Bu, iki farklı hücre popülasyonu ile sonuçlanır - enzimle tedavi edilmiş, glikojen eksikliği olan ve amilazla muamele edilmemiş, glikojen açısından zengin hücreler.

Bunları, glikojen moleküllerinin hidroksil gruplarını oksidatif olarak aldehitlere dönüştüren periyodik asit çözeltisi ile kaplayın.

Oksidasyon reaksiyonunu durdurmak ve fazla periyodik asidi gidermek için slaytı suda durulayın. Slaytı, periyodik asitle muamele edilmiş glikojenin aldehit gruplarıyla reaksiyona giren ve çözünmeyen macenta renkli bir kompleks oluşturan Schiff reaktifi ile muamele edin.

Görüntüleme sırasında hücreleri dizginlemek için montaj ortamı uygulayın. Daha iyi görselleştirme için montaj ortamını tüm slayt yüzeyine yaymak için bir lamel yerleştirin. Lekeli hücreleri görüntüleyin.

Amilaz ile muamele edilmeyen hücreler, enzimle muamele edilen hücrelerde bulunmayan macenta glikojen granülleri içerir.

Bu adımda, slaydı düz bir yüzeye yerleştirin. Numune üzerine 2 mililitre Periyodik Asit çözeltisi uygulayın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Ardından, slaytı damıtılmış suyla birkaç kez durulayın. Slayta 2 mililitre Schiff reaktifi uygulayın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Daha sonra, slaytı 5 dakika damıtılmış suyla yıkayın ve ardından kurumaya bırakın. Ardından, slayta 100 mikrolitre montaj ortamı uygulayın ve bir büyük lamel ile örtün veya 50 mikrolitre uygulayın ve iki küçük lamel kullanın. Bundan sonra, lamel kenarlarına şeffaf oje sürün. Gece boyunca kurumaya bırakın.

Ardından, 100X objektifini kullanarak Binoküler Işık mikroskobu ile görüntüler elde edin.