JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 2:50 dk. • July 8th, 2025
Periferik sinirler, miyelin kılıfını oluşturan çok sayıda lipit açısından zengin hücre zarı tabakası ile aksonların etrafını saran Schwann hücreleri ile çevrili aksonlardan oluşur.
Periferik sinirleri görselleştirmek için, sabit, reçine gömülü, osmiyum tetroksit ile tedavi edilmiş transvers sıçan periferik sinir bölümünü taşıyan bir cam slaytla başlayın. Reçineye gömülü bölümler doku morfolojisinin korunmasına yardımcı olur.
Osmiyum tetroksit tedavisi, doku bölgesinde miyelin kılıfının lipit tabakasında metalik osmiyum birikmesine neden olur.
Doku bölümü üzerine toluidin mavisi alkali çözeltisini pipetleyin. Slaytı uygun bir sıcaklıkta kurutun. Alkali koşullar ve ısı, toluidin mavisinin reçineden doku bölümüne nüfuz etmesini kolaylaştırır.
Katyonik bir boya olan toluidin mavisi, DNA üzerindeki negatif yüklü fosfat gruplarına bağlanır ve ayrıca Schwann hücre çekirdeğindeki DNA baz çiftleri arasında ara kümelenir. Ek olarak, boya, miyelin kılıfının dışındaki sitoplazmadaki RNA'ya bağlanır.
Lekeli sinir bölümünün üzerine bir montaj solüsyonu ekleyin ve dokuyu görüntülemeye hazırlamak için bir lamel ile örtün. Işık mikroskobu altında, miyelin kılıf tabakaları, osmiyum tedavisini takiben tanımlanmış miyelinli sinir lifi yapıları ile siyah görünürken, aksonlar boyanmadan kalır.
Schwann hücre çekirdeği ve sitoplazması, boyanın metakromatik özelliğinden dolayı mavinin farklı tonlarında görünür, bu da akson morfolojisinin görselleştirilmesini ve periferik sinirlerde miyelinasyon derecesini kolaylaştırır.
Sinir bölümlerini boyamak için, sinir bölümlerinin üstüne bir damla toluidin mavisi çözeltisi eklemek için plastik bir pipet veya mikro pipetleyici kullanın. 20 ila 30 saniye sonra, slaytları bir deiyonize su kavanozuna hafifçe daldırarak, bölümler temizlenene kadar 3 ila 4 kez tekrarlayarak tüm toluidin mavisi solüsyonu fazlalığını durulayın.
Slaytları 60 santigrat derecede en az 15 dakika veya gece boyunca oda sıcaklığında kurutun. Kuruduktan sonra, normal montaj ortamı ekleyin ve bölümleri bir lamel ile örtün. Son olarak, monte edilen bölümleri ışık mikroskobu altında inceleyin. G oranlarını hesaplamak için ayrıntılı görüntüler için 100X yağa daldırma lensi önerilir.