JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 3:32 dk • July 8th, 2025
Heterojen bir tümör hücresi popülasyonunda, bir anti-kanser ilacı ile tedavi çoğu hücreyi öldürür, ancak ilaca dirençli hücreler hayatta kalır ve bu da terapötik başarısızlıkla sonuçlanır.
İlaca dirençli hücrelerin oranını belirlemek için, çok kuyucuklu bir plakada heterojen bir tümör hücresi popülasyonunu tohumlayın. Hücre yapışmasını kolaylaştırmak için inkübe edin. Uygun bir antikanser ilaç çözeltisinin artan bir konsantrasyonunu ekleyin.
İlaç molekülleri ile etkileşim, hassas hücrelerin ölmesine ve ardından kültür plakalarından ayrılmasına neden olur. Buna karşılık, ilaca dirençli hücreler hayatta kalır ve plakaya bağlı kalır.
Ayrılan hücreleri çıkarmak için harcanan ortamı aspire edin. Taze ilaçsız ortam ekleyin ve plakayı fizyolojik koşullar altında inkübe edin. İlaca dirençli hücreler çoğalır ve tümör kolonileri oluşturur. Şimdi, kolonilere kristal viyole boyama çözeltisi ekleyin ve inkübe edin.
Mor renkli, zar geçirgen, pozitif yüklü bir leke olan kristal menekşe, hücrelere girer ve anyonik proteinleri ve DNA'yı bağlar, böylece hücrelere mor bir renk verir.
Ardından, reaksiyona girmemiş lekeyi çözündürmek için etanol ekleyin. Fazla lekeyi çıkarmak için yıkayın ve plakayı havayla kurutun.
İlaca dirençli koloniler mor noktalar olarak görünür. Her kuyucuktaki renkli kolonilerin sayısını sayın. Her ilaç konsantrasyonunda ilaca dirençli kanser hücrelerinin oranını belirlemek için bir grafikte hücre canlılığının yüzdesini temsil edin.
Bu prosedürde, 6 oyuklu plakalarda oyuk başına 2 mililitre ortam kullanarak 2000 hücre plakalayın. 24 saat sonra, hem DU145 hem de 22Rv1 hücre hatları için artan konsantrasyonlarda Docetaxel ekleyin. DMSO'yu yalnızca bir kuyucuğa ve en yüksek Docetaxel dozu için kullanılan aynı hacimde bir kontrole ekleyin.
72 saat sonra, ilaç içeren ortamı aspire edin ve taze Dosetaksel içermeyen ortam ekleyin. Koloniler mikroskop altında görünene kadar plakaları bir ila iki hafta inkübe edin.
Kolonileri lekelemek için, 2 ila 3 mililitre PBS ile nazikçe yıkayın ve doku kültürü başlığının veya çeker ocak içinde 20 dakika boyunca iki ila üç mililitre kristal viyole solüsyonu ile inkübe edin. Daha sonra boyama solüsyonunu çıkarın ve plakaları 2 ila 3 mililitre su ile yıkayın. Ardından suyu çıkarın ve plakaları havayla kurutun.
Şekil temsili için plakaların dijital görüntülerini alın. Kuyuları görselleştirerek ve bir işaretleyici kalem yardımıyla kolonileri manuel olarak sayarak sonucu analiz edin.