JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:37 dk. • July 8th, 2025
Drosophila larva oenositleri, cildin yüzeysel tabakası olan lateral epidermisin bazal yüzeyinde ayrı kümeler şeklinde bağlanan özel hücrelerdir. Bu oenositler öncelikle lipid metabolizmasında rol oynar.
Açlık sırasında, bu oenositler fazla lipid damlacıkları biriktirir. Her damlacık, bir fosfolipid tek tabakası ile çevrili, trigliseritler ve kolesterol esterleri gibi nötr lipitlerin hidrofobik bir çekirdeğinden oluşur.
Lipid damlacıklarını görselleştirmek için, bağlı oenositlerle Drosophila larva epidermisinin disseke edilmiş bir bölümünü alın. Proteazlar gibi hücresel proteinleri çapraz bağlamak ve oenositlerin yapısal bütünlüğünü korumak için paraformaldehit içeren bir sabitleme tamponu ile muamele edin. Sabitleme tamponunu çıkarın. Fotoağartmayı önlemek için karanlıkta floresan BODIPY bazlı bir boya ile inkübe edin.
İnkübasyon sırasında, polar olmayan boya, oenositlerin hücre zarı boyunca yayılır ve lipit damlacıklarını çevreleyen tek tabakayı geçer. Boya moleküllerinin hidrofobikliği, nötr lipitleri bağlamak için lipit damlacıklarının polar olmayan çekirdeğine hareketlerine izin verir.
Numuneyi, net görselleştirme için oenositler mikroskobik slayta dokunacak şekilde bir slayt üzerine monte edin. Numuneyi bir lamel kullanarak kapatın ve bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
Dört doksan üç nanometre dalga boyunda mavi ışıkla uyarıldığında, boya beş yüz üç nanometrede yeşil floresan yayar. Yeşil floresan lekeler, lipit damlacıklarının varlığını doğrular.
Lipid damlacık boyaması için, disseke epidermisi bir döndürücü üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca fiksasyon tamponunda inkübe edin, ardından 1 mililitre PBS'de hızlı bir yeniden süspansiyon yapın. Ardından, kalan fiksatifleri çıkarmak için numuneleri yıkama başına 1 mililitre PBS'de 5 dakikalık üç yıkama ile yıkayın.
Son yıkamadan sonra, epidermal numuneleri uygun bir lipofilik prob ile bir döndürücü üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, dokuları ışıktan korumak için numune tüplerini folyoya sarın ve numuneleri yıkama başına 10 dakika boyunca 1 mililitre PBS'de üç kez yıkayın.
Oenositleri görüntülemek için, her epidermis örneğini temiz bir mikroskop lamı üzerinde 6 mikrolitre montaj ortamına aktarın. Dokunun yönünü, oenositleri içeren iç yüzey slaydın altına değecek şekilde ayarlayın. Epidermisin üzerine nazikçe bir lamel yerleştirin ve kenarlarını şeffaf oje ile kapatın. Cila kuruduğunda, numuneleri uygun uyarma ve emisyon dalga boyları ile 63X büyütmede konfokal bir mikroskopta görüntüleyin.