JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:40 dk. • July 8th, 2025
Beyin iskemisi sırasında, beyne giden kan akışının bozulması, dokuya oksijen ve besin tedarikini azaltarak beyin hasarına neden olur. Kısa iskemiden sonra, beyne giden kan akışı yeniden sağlandıkça, artan oksijen kaynağı ile reperfüzyon, reaktif iyon türlerinin aşırı üretimine neden olur ve iskemi-reperfüzyon hasarı olarak bilinen oksidatif doku hasarına yol açar.
Bir sıçan modelinde iskemi-reperfüzyon hasarını takiben beyin hasarını değerlendirmek için önce sıçan beynini hasat edin. Kalıntıları ve kanı temizlemek için soğutulmuş bir tamponda durulayın. İstenilen kalınlıkta koronal dilimler elde etmek için beyni bölümlere ayırın. Sonraki boyama için dilimleri, ön yüzeyleri yukarı bakacak şekilde tampon içeren bir tepsiye dikkatlice aktarın.
Beyin dilimlerinin üzerine suda çözünür bir redoks boyası olan ılık trifenil tetrazolyum klorür, TTC çözeltisi ekleyin. TTC ışığa duyarlı olduğu için karanlık koşullarda inkübe edin. TTC, doku bölümündeki hücrelere girer.
Canlı hücrelerde, kofaktörlerin varlığında aktif mitokondriyal süksinat dehidrojenaz enzimi, oksitlendiğinde renksiz olan TTC'yi suda çözünmeyen, kırmızı formazana indirgeyerek canlı hücreleri koyu kırmızıya boyar. Bununla birlikte, nekrotik hücreler dehidrojenaz aktivitesinden yoksundur; Böylece, TTC oksitlenmiş formda kalır ve hücreleri beyaza boyar.
Kuluçka sonrası, beyin dilimlerini bir görüntüleme tepsisine aktarın. Sagital düzlemdeki yarım küreleri ayırın. Beyin dilimlerini görüntüleyin.
Sağlıklı doku kırmızı görünürken, hasarlı doku beyaz görünür, bu da nekrotik dokuyu canlı dokudan ayırır ve doku hasarının derecesinin tahmin edilmesini sağlar.
Beyin sapı da dahil olmak üzere beyni kafatasından çıkardıktan sonra, beyni ventral tarafı yukarı bakacak şekilde beyin matrisine yerleştirin. Hayvanların ağırlığına bağlı olarak, beyin paslanmaz çelik matrisinin doğru boyutunu seçin. Bıçakları kullanarak beynin ön ve kuyruk kısımlarını kısıtlayın. Ardından, bıçakları kısmen ilk ve son bıçaklar arasındaki kanallara yerleştirin.
Tüm bıçaklar paralel olarak yerleştirildiğinde ve düzenlendiğinde, beyni 2 milimetrelik koronal dilimler halinde kesmek için tüm bıçakları aynı anda avuç içi ile aşağı doğru bastırın. Ardından, bıçakları iki parmağınızla yanlardan sıkıca kavrayın ve dilimlenmiş beyinle birlikte matristen çıkarın. Beyin dilimlerini bir tepsiye tek tek yerleştirin ve her dilimin ön yüzeyinin her zaman yukarı baktığından emin olun.
Daha sonra, ılık% 1 trifenil tetrazolyum klorür çözeltisi ve PBS'yi beyin dilimlerine dökün ve karanlıkta 37 santigrat derecede 8 dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra, görüntüleri yakalamak için beyin dilimlerini mavi plastik bir tepsiye aktarın. Beyin dilimlerini frontalden kaudal kısma doğru sıralı olarak düzenleyin ve sagital düzlemdeki yarım küreleri ayırmak için bir neşter kullanın.