JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:08 dk. • July 8th, 2025
Osteoklastlar, kemik yüzeyinde bulunan büyük, kubbe şeklinde, çok çekirdekli hücrelerdir. Bu hücreler, tartarat dirençli asit fosfataz veya osteoklastların kıvrımlı sınırından kemik dokusuna salgılanan bir metaloprotein enzimi olan TRAP açısından zengin çok sayıda sitoplazmik granül içerir. Bu enzim hücre dışı matrisi sindirir ve mineral kristallerini çözerek kemik erimesini kolaylaştırır.
TRAP granüllerini osteoklastların sitokimyasal belirteçleri olarak tespit etmek için, yapışkan osteoklastlar içeren bir kültür kabı alın. Hücrelere TRAP boyama solüsyonu ekleyin. Bu çözelti, bir diazonyum tuzu ile desteklenmiş bir tampon içinde fosfat içeren bir naftol türevi ve tartarik asit olan substratı içerir.
TRAP boyama için gerekli asidik pH'ı korumak için bu çözeltiye asetik asit ekleyin. Optimum TRAP enzim aktivitesi için hücreleri karanlıkta fizyolojik sıcaklıkta inkübe edin.
Boyama çözeltisi, tartarik asidin diğer hücrelerdeki tartarat duyarlı asit fosfatazların hidrolize edici aktivitesini inhibe ettiği osteoklastlara girer.
Aynı zamanda TRAP, fosfat grubunu uzaklaştırmak için eklenen substratı hidrolize eder. Hidrolize substrat, kestane rengi çözünmeyen bir boya kompleksi oluşturmak için boyama çözeltisinden bir diazonyum tuzu ile birleşir. Bu kompleks, enzimatik aktivite bölgelerinde granüller halinde çökelir.
Hücreleri mikroskop altında görüntüleyin. Sitoplazma içinde bordo boya granüllerinin birikmesi, kültürde TRAP içeren osteoklastların varlığını doğrular.
Bu adımda, ortamı aspire edin ve numuneyi 1X PBS ile üç kez nazikçe yıkayın. Daha sonra, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundaki hücreleri, oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 100 mikrolitre sabitleme çözeltisi ile sabitleyin.
Fiksasyondan sonra, sabitleme solüsyonunu aspire edin ve hücreleri önceden 37 santigrat dereceye ısıtılmış deiyonize su ile üç kez nazikçe yıkayın. Ardından, deiyonize suyu aspire edin ve 96 oyuklu plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre TRAP boyası ekleyin.
Plakayı 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin ve ışıktan koruyun. Boyamadan sonra, TRAP lekesini aspire edin ve deiyonize su ile üç kez nazikçe yıkayın. Daha sonra, osteoklastları 40X büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskopta görüntüleyin.