JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:15 dk. • July 8th, 2025
Sülfatlanmış glikozaminoglikanlar, GAG'lar, farklı uzunluklarda bulunan, farklı pozisyonlarda sülfatlanmış tekrarlayan disakkarit birim zincirlerine sahip uzun, negatif yüklü, doğrusal polisakkaritlerdir.
Elektroforezi takiben bir poliakrilamid jelde zincir uzunluğu bakımından farklılık gösteren izole sülfatlanmış GAG'ları görselleştirmek için, jeli kasetinden dikkatlice çıkarın. Deiyonize su ile durulayın, lekelenmeye müdahale edebilecek bağlı jel parçalarını çıkarın.
Asidik bir Alcian mavisi çözeltisi ile tedavi edin. Asidik koşullar altında, merkezinde bir bakır atomu bulunan çok değerlikli bir katyonik boya olan Alcian mavisi, iyonik etkileşimler yoluyla negatif yüklü sülfatlanmış GAG'lerle spesifik olarak etkileşime girerek koyu mavi suda çözünmeyen bir kompleks oluşturur.
Jeli deiyonize su ve metanol ile yıkayın ve kalan lekeleri çıkarın. Jeli bir alkali gümüş nitrat çözeltisi ile inkübe edin. Alkali koşullar altında, Alcian mavisine bağlı sülfatlanmış GAG'lar, pozitif yüklü gümüş iyonlarının bağlanması ve kompleks oluşturması için alanlar sağlar.
Jeli, formaldehit ve sitrik asit içeren gelişmekte olan bir çözelti içinde muamele edin. Sitrik asit, formaldehitin optimum aktivitesi için yerel pH'ı düşürür, bu da gümüş iyonlarını sülfatlanmış GAG fragmanları içinde çözünmeyen metalik gümüşe indirgeyerek Alcian mavisi sinyalini yükseltir.
PH'ı düşürmek için bir durdurma solüsyonu ekleyin, minimum arka plan lekelenmesi için gümüş iyonlarının azalmasını önleyin. Şimdi, jeli görüntüleyin.
Alcian mavi-gümüş lekeli sülfatlanmış GAG fragman bantları koyu kahverengi veya siyah görünür, bu da izole edilmiş GAG polimer zincir uzunluklarının yüksek hassasiyetli görselleştirilmesini ve belirlenmesini sağlar.
Çalışma tamamlandığında, kaseti sökün ve jeli deiyonize edilmiş, filtrelenmiş suyla dolu büyük, temiz bir kaba dikkatlice çıkarın. Ardından suyu atın ve jeli Alcian mavisi boyama solüsyonunda beş dakika boyayın. Alcian mavisi lekesini atın ve Alcian mavisi boyama solüsyonunun çoğu çıkana kadar iki ila üç kez deiyonize edilmiş, filtrelenmiş su ile hızlı bir şekilde yıkayın.
Jeli gümüş nitrat boyama solüsyonunda taze, temiz bir kapta 30 dakika boyunca boyayın. Daha sonra, gümüş lekeleme solüsyonunu tamamen çıkarmak için her biri 30 dakika boyunca iki ila üç kez deiyonize filtrelenmiş suda yıkayın. Suyu atın ve geliştirici çözelti ekleyin.
Bantların görünümü için jeli dikkatlice gözlemleyin. Lekenin kalitesine ve yüklenen numunenin kütlesine bağlı olarak, geliştirme birkaç saniyeden birkaç dakikaya kadar sürebilir. İstenen bantlar görünür görünmez, gelişmekte olan çözeltiyi hemen atın ve jeli kısa bir süre durdurma çözeltisi ile yıkayın.