JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 2:42 dk. • July 8th, 2025
Proteoglikanlar, sülfatlanmış glikozaminoglikan zincirlerine kovalent olarak bağlı bir çekirdek proteinden oluşur.
Proteoglikanları görselleştirmek için, kollajen bazlı iskelelerle (gözenekli polimerik substrat) başlayın ve mezenkimal kök hücreyi veya MSC'yi üzerlerine süpürün. Bu, MSC'lere yapısal destek sağlar ve iskelelerin boşluklarının yanı sıra yüzeyde de büyümelerine izin verir.
Yapıları, MSC'lerin olgun kondrositlere - kıkırdaklı hücrelere dönüşümünü sağlayan dönüştürücü büyüme faktörleri içeren kondrojenik bir farklılaşma ortamında tedavi edin. Olgun kondrositler, iskeledeki kollajen ile bir ağ oluşturan proteoglikanlar salgılar.
Kondrosit yüklü yapıdan hazırlanan bir bölümü ele alalım. Guaidyum hidroklorür ile desteklenmiş asidik bir alcian mavisi leke çözeltisi ekleyin ve inkübe edin. İnkübasyon sırasında, boya çözeltisindeki guanidin hidroklorür, daha iyi boyama için herhangi bir proteoglikan agregasını ayrıştırır.
Daha sonra, proteoglikanlardan gelen negatif yüklü sülfatlanmış glikozaminoglikanlar, bakır içeren pozitif yüklü alcian mavisi boya moleküllerine bağlanarak mavi tortulara neden olur.
Ardından, slaydı magnezyum klorür içeren leke giderici bir çözeltiye batırın. Magnezyum iyonları, glikozaminoglikanlar üzerindeki bağlanma bölgeleri için pozitif yüklü boya molekülleri ile rekabet eder, böylece aşırı lekelenmeyi önler.
Bölümü görüntüleyin. Mavi renklenme, numunedeki proteoglikanların varlığını doğrular
Liyofilize kollajen tip 1'den oluşan sünger şeklindeki bir tıbbi cihazdan kondrojenik farklılaşma yapmak için, her iki tarafta 3 milimetre küpler kesin. MSC'leri küplerin üzerine 4 x 106 hücre / ml konsantrasyonda tohumlayın.
Hücrelerin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca küplere yapışmasına izin verdikten sonra, MSC-kollajen yapılarını metin protokolünde listelendiği gibi kondrojenik ortamda tutun. Bölümlere% 0.4 Alcian mavisi çözeltisi ekleyin ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, hücreleri lekelemek için nükleer hızlı kırmızı kullanmadan önce hücreleri 30 dakika yıkamak için% 40 DMSO ve 0.05 molar magnezyum klorür kullanın.