Masson Goldner Trikrom Boyama: Kardiyovasküler Fibroz Tespiti için Kalp Bölümlerindeki Kollajeni Görselleştirme Tekniği
JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 4:14 dk • July 8th, 2025
Stresle aktive olan kardiyak fibroblastlar, yaralı bölgelerde aşırı kollajen biriktirir, bu da fibroz adı verilen ve kalp fonksiyonunu bozan bir durumdur.
Fibrozisin derecesini görselleştirmek için önce parafine gömülü kalp bloklarını bölümlere ayırın. Bölümleri bir slayta yerleştirin. Parafini eritmek için slaytı ısıtın ve bölümlerin yapışmasına izin verin.
Dokuyu deparafinize etmek için slaydı ksilole batırın. Bölümleri yeniden sulandırmak ve sulu leke bileşenlerinin daha sonra bağlanmasına yardımcı olmak için bölümleri azalan alkol kuvvetleriyle tedavi edin.
Bölümleri, proteinleri çapraz bağlayan ve doku yapısını stabilize eden asidik bir fiksatif içinde inkübe edin. Kalan fiksatifi çıkarmak için suyla durulayın.
Slaytı hematoksilen çözeltisine daldırın. Katyonik boya, negatif yüklü DNA'yı bağlayarak çekirdeği maviye boyar. Fazla lekeyi çıkarmak için suyla durulayın.
Slaytı, pozitif yüklü sitoplazmik proteinler ve kollajen ile etkileşime giren ve onları kırmızıya boyayan küçük moleküllü bir anyonik boya olan asit Fuchsin-Ponceau içinde inkübe edin. Fazla lekeyi çıkarmak için seyreltilmiş asetik asit ile muamele edin.
Slaytı fosfomolibdik asit-Turuncu G çözeltisine daldırın. Küçük moleküllü bir boya olan Orange G, eritrositleri turuncu-kırmızı renge boyar. Büyük moleküllü bir asit olan fosfomolibdik asit, küçük moleküllü boyaları kolajenden dışarı atarak onu renksiz hale getirir.
Bölümleri, molekülleri kollajen liflerini bağlayan ve yeşile boyayan açık yeşil boya ile inkübe edin. Mikroskop altında, fibrotik bölgeler aşırı kollajen birikimini gösteren yeşil görünür.
Bu prosedürde, manuel bir mikrotom ile parafin bloklarından beş mikron kalınlığında doku kesitleri hazırlayın. Daha sonra, Masson-Goldner Trikrom boyama ile her sıçan için her kalp bölümünden bir slayt boyayın. Parafin bölümleri için dokuları 60 derecede bir fırında eritin. Bir davlumbaz altında, her biri 10 dakika boyunca iki kez ksilol içinde parafinden arındırın.
Daha sonra bunları %100 etanol, %95 etanol, %70 etanol ve ardından her biri üç dakika damıtılmış su ile yeniden sulandırın. Parafinden arındırılmış bölümler ve kriyo bölümler için, bunları gece boyunca Bouin çözeltisine sabitleyin. Ertesi sabah, akan musluk suyunda 10 ila 15 dakika durulayın. Ardından damıtılmış su kullanarak tekrar durulayın.
Bouin'de fiksasyon, muhteşem bir Goldner boyaması sağlamak için en önemli adımdır.
Onları Mayer'in hematoksilininde üç dakika inkübe edin. 3 dakika sonra slaytları çıkarın ve beş dakika damıtılmış suda bırakın. Daha sonra, bir dakika boyunca% 1 asetik asit ile durulamadan önce, Ponceau asidi Fuchsin'de beş dakika inkübe edin.
Daha sonra, bölümleri bir dakika boyunca fosfomolibdik asit Orange G'de inkübe edin ve ardından bir dakika boyunca% 1 asetik asit içinde durulayın. Açık yeşil boyada 10 dakika inkübe edin ve ardından bir dakika% 1 asetik asit içinde durulayın. Son olarak, bölümleri sırayla 30 saniye boyunca %70 etanol, 30 saniye boyunca %95 etanol ve beş dakika boyunca %100 etanol içinde kurutun. Doku bölümlerine bir damla reçineli montaj ortamı sürün, üzerlerini lamellerle örtün ve kurumaya bırakın.
Genel Bakış
Bu makale, kalp dokusundaki fibrozisin görselleştirilmesi yöntemini, özellikle stresle aktive olan kardiyak fibroblastlar tarafından gerçekleştirilen aşırı kolajen birikimine odaklanarak ele almaktadır. Prosedür, fibrotik bölgelerin mikroskop altında belirginleştirilmesi için çeşitli boyama tekniklerini içermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyak biyoloji
- Histolojik teknikler
- Fibrozis değerlendirmesi
Arka Plan
- Fibrozis, normal doku mimarisini bozarak kalp fonksiyonlarını bozar.
- Kardiyak fibroblastlar, stres koşulları sırasında kolajen birikiminde kritik bir rol oynar.
- Fibrozisin görselleştirilmesi, kardiyak patolojiyi anlamak için gereklidir.
- Çeşitli doku bileşenlerini birbirinden ayırt etmek için boyama teknikleri kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- Kardiyak dokuda kolajen birikimini değerlendirmek için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Fibrotik bölgeleri görselleştirmek için spesifik boyama tekniklerini kullanmak.
- Kardiyak fibroblastların fibrozisteki roluna dair anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Parafin gömülü kalp bloklarının beş mikron kalınlığında dilimler halinde kesilmesi.
- Kesitlerin ksilol ile deparafimize edilmesi ve azalan alkol konsantrasyonları ile yeniden hidrate edilmesi.
- Hematoksilen, asit Füksin-Ponceau ve açık yeşil boya ile boyama.
- Boyamaya dayalı olarak fibrotik bölgelerin belirlenmesi için mikroskobik inceleme.
Temel Sonuçlar
- Fibrotik bölgeler, mikroskop altında yeşil renkli olarak başarıyla görüntülendi.
- Boyama prosedürü, kollajen depozisyonunu etkili bir şekilde belirginleştirdi.
- Kollajen lifleri, diğer doku bileşenlerinden ayırt edildi.
- Yöntemin, kalp dokularındaki fibrozisin değerlendirilmesinde güvenilir olduğu kanıtlandı.
Sonuçlar
- Geliştirilen boyama protokolü, kardiyak fibrozisin görüntülenmesinde etkilidir.
- Bu yöntem, fibrozis ile ilişkili kardiyak patolojilerin incelenmesine yardımcı olabilir.
- Gelecekteki araştırmalar, terapötik müdahaleleri araştırmak için bu tekniklerden yararlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Kardiyak dokudaki kollajen birikiminin görüntülenmesi, fibrozisle ilişkili terapötik hipotezlerin mekanistik olarak risk analizinin yapılmasına olanak tanır. Bu histolojik yaklaşım, hücre dışı matris yeniden şekillenmesine ilişkin kantitatif ve tekrarlanabilir okumalar sağlayarak hedef doğrulamayı destekler. Kardiyovasküler ilaç keşfinde preklinik model seçimini ve portföy önceliklendirmesini bilgilendirir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hastalıklı miyokarddaki kollajen depozisyonunun doğrudan görselleştirilmesi yoluyla antifibrotik hedef etkileşiminin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Kemirgen enfarkt modellerinde fibroblast aktivasyonu ve matriks yeniden şekillenmesinin standartlaştırılmış, kalitatif bir değerlendirmesini sunar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Patolojik kolajen sentezini yönlendiren moleküler yolaklarla ilişkili doku tabanlı okumalar sağlar.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış boyama protokolleri ve kesit alma parametreleri aracılığıyla laboratuvarlar arası analiz standardizasyonunu destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Fibroblast aktivitesini fonksiyonel fibrozis sonuçlarıyla ilişkilendirerek hastalığa özgü sistem karakterizasyonunu kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Preklinik etkinlik çalışmalarında antifibrotik bileşiklerin etkilerinin boylamsal olarak izlenmesine olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, kardiyovasküler hastalık modellerinde hedef modülasyonunun histopatolojik onayını sağlayarak, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Doğrudan doku görselleştirmesi aracılığıyla fibroblast kaynaklı yolakların hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Fibrozis modellerinde bileşik etkilerinin karşılaştırılması için tekrarlanabilir, kantitatif değerlere yakın çıktılar sağlar.
- Analizler: Boyama yoğunluğu ve dağılım analizi yoluyla fibrotik alanın yarı kantitatif değerlendirmesine olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Doğrulanmış fibrozis son noktaları aracılığıyla mekanistik bulguları preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Kardiyovasküler fibrozis endikasyonu taraması için yeniden kullanılabilir bir histoloji platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Fibrozis fenotiplemesindeki belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış fiksasyon, boyama ve kesit alma protokolleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Hedef modülasyonuna dair histopatolojik kanıtlar sunarak go/no-go (devam/durdur) kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Hedef etkileşim kanıtlarına dayanarak antifibrotik adayların risk ayarlı önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Doku kesme ve boyama yorumlama konusunda histoloji uzmanlığı.
- Mikrotomlara, boyama reaktiflerine ve aydınlık alan mikroskobuna erişim.
- Operatörler arasında fikse etme süresinin ve boyama sürelerinin standartlaştırılması.
- Kemirgen olmayan veya insan doku modelleri için adaptasyon hususları.
- Dijital görüntü analizi veya hidroksiprolin analizlerine kıyasla kantitatif hassasiyetteki sınırlamalar.
Biyofarma SSS
Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Murin Kısa Eksenli Ventriküler Kalp Dilimleri
İlgili videolar
0 Görüntüler
Farede Miyokard Enfarktüsü Çalışması İçin Kriyoyaralanma Modeli
İlgili videolar
0 Görüntüler
Miyokard İskemisi ve Reperfüzyon Hasarının Geliştirilmiş Kemirgen Modeli
İlgili videolar
0 Görüntüler
Picrosirius Kırmızı Polarizasyon Boyama: Parlak Alan Mikroskobu Kullanarak Kardiyak Doku Kesitlerinde Fibrozu Tespit Etme Tekniği
İlgili videolar
0 Görüntüler
Miyokard Mikroyapısının Ultrasonik Değerlendirmesi
İlgili videolar
0 Görüntüler
Intramiyokardiyal Hücre Teslimat: Mürin Hearts Gözlemler
İlgili videolar
0 Görüntüler
Görselleştirme
İlgili videolar
0 Görüntüler
Macerated Tissue taramalı elektron mikroskobu Ekstraselüler Matrix Visualize'a
İlgili videolar
0 Görüntüler
3D Tüm kalp Miyokard Doku Analizi
İlgili videolar
0 Görüntüler
Kardiyak resenkronizasyon sol paket şube ablasyon ve hızlı Pacing tarafından indüklenen bir zaman uyumsuz kalp yetmezliği modelindeki faydaları
İlgili videolar
0 Görüntüler
Son güncelleme: 29 Ağustos 2026