JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 3:03 dk • July 8th, 2025
Kahve pasında, patojenik bir mantar olan Hemileia vastatrix'in sporları bitki yüzeyine iner ve bir çimlenme tüpü oluşturur, böylece hifler yoluyla bir enfeksiyon başlatır.
Bu hifler dokunun içine yayılır ve bitki besin maddelerini emen haustoria adı verilen özel parmak benzeri yapılar aracılığıyla bitki hücrelerini istila eder. Haustoria ayrıca bitkinin direnç proteinleri tarafından tanınan efektör molekülleri salgılar ve bu da enfeksiyonu kısıtlamak için haustoria'nın pektin açısından zengin kapsüllenmesine yol açar.
Bu etkileşimi görselleştirmek için ultra ince, reçine gömülü, enfekte bir kahve yaprağı bölümüyle başlayın. Şimdi, numuneyi fenol, laktik asit, gliserol ve pamuk mavisi içeren histolojik bir leke olan laktofenol pamuk mavisi ile muamele edin. Slaytı kısa bir süre ısıtın.
Boya bileşenleri dokuya nüfuz ettikçe, fenol herhangi bir canlı organizmayı ortadan kaldırırken, laktik asit ve gliserol hücresel mimarinin korunmasına yardımcı olur. Eşzamanlı olarak, pamuk mavisi molekülleri, mantar hücre duvarındaki kitin parçalarına bağlanır ve onu maviye boyar.
Numuneyi damıtılmış suyla yıkayın. Ardından, numuneyi rutenyum kırmızı boya ile muamele edin.
Pozitif yüklü rutenyum molekülleri, pektin açısından zengin bitki hücre duvarındaki negatif yüklü polisakkaritlere bağlanır ve onu kırmızıya boyar. Yine, slaytı yıkayın ve mikroskop altında görselleştirin.
Pektin bakımından zengin bitki hücre duvarı kırmızı görünür ve mavi mantar hiflerinden uzanan mavi haustoria'yı kapsar.
8 santimetre çelik bıçaklarla donatılmış döner bir mikrotom kullanarak bloğu 5 mikrometre kalınlığında bölümler halinde kesin. Bölümleri damıtılmış suyla kaplı cam slaytların üzerine yerleştirin, ardından slaytları 40 santigrat derecede kuruması için sıcak bir plakaya aktarın ve bölümlerin cam slaytlara yapışmasını sağlayın.
Kuruduktan sonra, cam slaytları blok referans adı ve slayt numarası ile etiketleyin. Bölümleri laktofenolde 2 mililitre% 5 pamuk mavisi ile kaplayın ve beş dakika boyunca 45 santigrat derecede sıcak bir plakada ısıtın.
Slaytı damıtılmış suyla doldurulmuş bir beherde üç kez yıkayarak fazla boyayı çıkarın. Bir dakika boyunca suda 2 mililitre% 0.01 rutenyum kırmızısı ile boyayın.
Slaytı damıtılmış suyla doldurulmuş bir beherde üç kez yıkayarak fazla boyayı çıkarın. Bölümlerin üzerine bir damla damıtılmış su koyun ve ışık mikroskobu analizi yapmak için bölümleri bir lamel ile örtün.