JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 2:49 dk • July 8th, 2025
Fibrozis, hasarlı dokunun hücre dışı matriksinde fibriller kollajen birikiminin artmasıdır. Yapısal olarak, üçlü sarmal kollajen polipeptit zincirlerinden oluşur.
Kollajeni picrosirius kırmızı boyası ile boyamak için paraformaldehitle sabitlenmiş, parafine gömülü bir kalp dokusu bölümü alın. Çevreleyen balmumu çözmek için doku bölümünü organik bir çözücü olan ksilene daldırın.
Deparafinize edilmiş dokuyu, ksilenin yerini almak için azalan alkol konsantrasyonları ile sırayla tedavi edin. Sonraki adımlarda daha iyi leke görselleştirmesi için dokuyu yeniden sulandırmak için suya batırın.
Dokuyu Sirius kırmızısı - anyonik bir azo boyası - ve pikrik asit içeren picrosirius kırmızı çözeltisine batırın.
Sirius kırmızısı, kollajende bulunan lizin, hidroksilisin ve arginin temel amino grupları ile etkileşime giren asidik sülfonik gruplar içerir. Pikrik asit, asidik pH'ın korunmasına yardımcı olur ve boya moleküllerinin kollajen ile paralel bir yönde bağlanmasını kolaylaştırır.
Fazla lekeyi çıkarmak için slaytları asitleştirilmiş bir leke giderme solüsyonunda durulayın. Slaytın üzerine bir damla montaj ortamı koyun ve parlak alan mikroskobu altında görüntüleyin.
Kollajen içeren fibrotik alan, fibrotik olmayan, sarı renkli bölgelere kıyasla parlak kırmızı görünür.
Kalp dokusunu sabitledikten sonra, bir doku kesit alma cihazına yerleştirin, 2 milimetre kalınlığında dilimler halinde kesin ve bölümleri bir gömme kasetine yerleştirin.
Parafin gömme ve metin protokolüne göre ek bölümlere ayırmanın ardından, slaytları 30 dakika boyunca ksilen içeren bir tanka yerleştirerek deparafinize edin. Ardından, dokuyu sıralı olarak seyreltilmiş bir alkol serisinde ve ardından damıtılmış su içinde yeniden sulandırın.
Daha sonra, doku bölümlerini tamamen kaplamak için yeterli picrosirius kırmızı solüsyonu kullanın ve bir saat inkübe edin. Ardından, slaytları iki kez durulamak için% 0.5'lik bir asetik asit çözeltisi kullanın ve numuneleri iki kez mutlak alkolde durulayın.
Numuneleri havayla kurutun ve bir lamel ile sentetik reçineye monte edin. Ardından, slaytları görüntülemek için 200X büyütmede mikroskop altında görünür ışık kullanın.