JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 4:48 dk. • July 8th, 2025
Ateroskleroz, arterlerin iç astarında lipoproteinlerin birikmesi nedeniyle oluşur, bu da plak birikimine, arterlerin kalınlaşmasına ve daralmasına ve kan akışının azalmasına neden olur.
Plaklar, enflamatuar hücrelerle birlikte, düşük yoğunluklu lipoproteinlerden, LDL'lerden - hidrofobik bir kolesterol esterleri ve trigliserit çekirdeğine sahip küresel parçacıklardan - oluşan bir çekirdeği çevreleyen düz kas hücreleri ve hücre dışı matrisli lifli bir kapaktan oluşur.
Lipid açısından zengin aterosklerotik plakları görselleştirmek için, yeni hasat edilmiş bir fare aort kemeri elde edin. Geniş alanlı görüntüleme sırasında daha iyi kontrast için koyu arka plana göre özelleştirilmiş bir platforma aktarın. Doku dehidrasyonunu önlemek için tampon ekleyin.
Yanlış arka plan lekelenmesini önlemek için aort arkını çevreleyen perivasküler yağ dokusunu çıkarın. Aterosklerotik plak birikimi ile en iç yüzeyi ortaya çıkarmak için aortu ve dallarını lümen boyunca uzunlamasına kesin.
Açılan aort arkını platforma sabitleyin ve etanol içinde inkübe edin. Etanol, dokudaki suyun yerini alır, proteinleri etkisiz hale getirir ve doku mimarisini korur.
Organik çözücüler içinde çözündürülmüş Sudan IV lekesi ile muamele edin. Plak içinde, lipoproteinlerin trigliseritleri ve kolesterol esterleri için yüksek afiniteye sahip yağda çözünen bir diazo boya olan Sudan IV, organik çözücü fazından hareket eder ve LDL'lerin hidrofobik lipit çekirdeğine bağlanarak kararlı kompleksler oluşturur. Etanol kullanarak fazla lekeyi yıkayın.
Stereomikroskop altında, lekeli lipid açısından zengin aterosklerotik plaklar turuncu-kırmızı görünürken, plak olmayan alanlar soluk görünür.
Yüz analizi için bir sabitleme yatağı hazırlamak için, 25 x 25 milimetrelik düz bir yüzey oluşturmak için parafin balmumu filminin bir parçasını 8 kez katlayın ve aort için koyu bir arka plan oluşturmak için filmin etrafına siyah elektrik yalıtım bandı sarın.
Sabitleme yatağının arka tarafına bir etiket yerleştirin ve fare kimlik numarasını yazmak için kurşun kalem kullanın. Aort arkını sabitleme yatağına aktarın ve dokuya bir damla PBS ekleyin. Bir stereomikroskop kullanarak, aortu kalan periadventisyel yağ dokusundan temizleyin ve aortu manipüle etmeden veya zarar vermeden çevredeki tüm yağ dokusunu nazikçe soymak için Vannas makası ve Dumont forseps kullanın.
Ardından, intimal yüzeyi ortaya çıkarmak için Vannas makasını aort lümenine sokun. Yükselen kemerin dış eğriliğini distal yönde kesmeye başlayın, brakiyosefalik arter de dahil olmak üzere dalları kesmeye devam edin ve inen torasik bölgenin dorsal kısmını koruyun.
İntimal yüzeyi görüntülemek için, daha küçük eğriliği kesin ve aortu katlayarak açın. Bir mikro Castroviejo iğne tutucusu kullanarak, açık kemeri, numuneyi germeden minutien böcek pimlerinin kör ucuyla sabitleme yatağına sabitleyin, doku yerinde tutulurken pimleri numuneden hafifçe bükün. Ardından, sabitlenmiş kemeri yüzü aşağı bakacak şekilde 4 santigrat derecede bir PBS Petri kabında saklayın.
Sudan IV boyaması için, numuneyi 7 dakika boyunca bir Sudan IV çalışma solüsyonu kabına aktarmadan önce, kemeri aşağı bakacak şekilde% 70 etanol içeren bir Petri kabında 5 dakika durulayın.
İnkübasyonun sonunda, normal intimal yüzeyin lekesini çıkarmak için numuneyi %80 etanol içinde 3 dakikalık iki yıkama ile durulayın ve ardından dokuyu orijinal Petri kabına geri koymadan önce PBS'de son bir durulama yapın. Ardından, 10X büyütmeli bir dijital kameraya bağlı bir stereomikroskop altında mikrograflar elde edin, sabitleme yatağını Petri kabının dibine tutmak için küçük metal ağırlıklar kullanarak PBS'ye batırılmış sabitlenmiş kemerin görüntülerini elde edin.