JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 2:59 dk. • July 8th, 2025
Diyalize edilmiş bir bakteriyel protein lizatından ilgilenilen bir proteinin anyon değişim kromatografisi ile ayrılması için, lizat viskozitesini azaltmak ve kromatografik kolonu tıkamasını önlemek için bir bağlayıcı tampon ekleyin.
Tampondaki şelatlama maddeleri, iki değerlikli katyonları bağlayarak proteaz aktivitesini inhibe eder ve protein bozulmasını önler. Ek olarak, hedef proteinin izoelektrik noktasının, pI'nin, proteinin net yükünün olmadığı pH'ın üzerinde olan tampon, aşırı negatif yüklü hidroksil iyonlarının proteinin pozitif yüklü amin gruplarını nötralize etmesine neden olarak proteinin yüzeyini negatif yüklü hale getirir.
Pozitif yüklü kuaterner amin grupları ile çapraz bağlı, agaroz bazlı sabit faz içeren anyon değişim kromatografisi kolonunu birleştirin. Numune yüklemesi sırasında sütunu maksimum protein etkileşimine hazırlamak için bağlayıcı tamponu ekleyin. Seyreltilmiş bakteri lizatını yükleyin.
Negatif yüklü hedef proteinler, kolondaki pozitif yüklü gruplara daha az negatif yüklü proteinlere göre daha sıkı bağlanır.
Bağlanmamış pozitif yüklü proteinleri kolondan çıkarmak için bağlayıcı tamponu çalıştırın. Kolondan bir elüsyon tamponu geçirin ve tuz konsantrasyonunu kademeli olarak artırın. Düşük tuz konsantrasyonlarında, negatif iyonlar kolona bağlanmak için zayıf bağlı proteinlerle rekabet eder ve elüsyonlarına neden olur.
Daha sonra, yüksek tuz konsantrasyonu tamponu, hedef proteinleri ayrıştırarak, daha uzun bir tutma süresi ile sıkıca bağlanmış ilgili proteinlerin yerini alır. Toplanan hedef proteinler daha ileri analizler için kullanılabilir.
FPLC'yi genel bakımla başlatın. AIEX-A ve AIEX-B kolon tamponlarını tampon valflerine ve anyon değiştirici reçine içeren kolonu FPLC'nin kolon portlarına bağlayın. Genel kromatografik parametreleri buna göre ayarlayın.
FPLC yazılımında AIEX programını başlatın ve tampon A için dengeleme hacmini seçin. Daha sonra, numuneyi kolona yükleyin ve proteinleri %0 ila %100 arasında yüksek tuz tamponu ile doğrusal bir gradyanla elüte edin. Elüsyon sırasında 2 mililitrelik fraksiyonları toplayın.
Çalışmayı bitirdikten sonra ayrıştırılan kesirleri analiz edin.