Nikel Afinite Kromatografisi Bazlı Protein Saflaştırması: Polihistidin Etiketli Rekombinant Proteinleri Bakteriyel Hücre Lizatından Saflaştırmak İçin Bir Teknik

Poli-histidin etiketine kaynaşmış rekombinant proteini - bir terminalde bir dizi histidin kalıntısı - bir bakteri hücre lizatından saflaştırmak için, önce kromatografik çalışma sırasında kolon tıkanmasını önlemek için hücre lizatını seyreltin.

Bir kenetleme maddesi olan nitrilotriasetik asit kullanılarak bir agaroz boncuk matrisi üzerine hareketsiz hale getirilmiş iki değerlikli nikel katyonları içeren bir afinite kolonunu birleştirin. Nitrilotriasetik asit, nikel katyonlarını dört koordinat kovalent bölge aracılığıyla bağlarken, metal iyonu üzerindeki iki bölge, ilgilenilen proteindeki poli-histidin etiketleri ile etkileşimler için mevcut kalır.

Etkili metal-protein etkileşimleri için koşulları optimize etmek üzere kolonu uygun tamponla dengeleyin. Hücre lizatını kolona yükleyin.

Erişilebilir terminal histidin kalıntıları taşıyan rekombinant proteinler, metal iyonunun histidinin yan zinciri olan imidazole olan yüksek afinitesi nedeniyle nikel katyonları ile koordinasyon bağları oluşturur ve matrise bağlanır. Rekombinant proteindeki yüksek ardışık histidin sayısı, matrise olan bağlılığını güçlendirir.

Buna karşılık, histidin kalıntıları olmayan proteinler kolona yapışmaz ve akışta