JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyolojik Teknikler
0 görüntüleme • 3:26 dk • July 8th, 2025
Mikobakteriyel hücre duvarı, mikolik asitlerin farklı varyantlarını içerir - korunmuş alfa zincirlerine sahip uzun zincirli yağ asitleri. Beta zincirlerinde yapısal farklılıklar vardır ve bu da farklı mikolik asitlerin polaritesindeki değişikliklere neden olur.
Varyantları ince tabaka kromatografisi veya bir sıvı kromatografi tekniği olan TLC kullanarak ayırmak için, istenen organik çözücü içinde mikobakteriyel hücre duvarı lipitlerini alın. Lipitleri, sabit faz olarak işlev gören ince bir adsorban malzeme tabakası ile önceden kaplanmış bir TLC plakasının tabanına yakın bir yerde tespit edin.
Plakayı, mikolik asitlerin erken difüzyonunu önlemek için sıvı seviyesinin numune noktalarının altında olduğundan emin olarak organik bir çözücü - mobil faz - içeren bir kavanozun içine yerleştirin.
Çalışma sırasında, mobil faz, kılcal hareket yoluyla plaka üzerindeki adsorban tabakanın küçük gözeneklerinden yükselir. Sonunda, mikolik asitler çözücü içinde çözünür ve yukarı doğru hareket eder.
Daha polar mikolik asit varyantları, moleküller arası kuvvetler yoluyla polar durağan faz tarafından geçici olarak adsorbe edilir ve yukarı doğru hareketlerini engeller. Daha az polar mikolik asitler polar olmayan mobil fazda kalır ve daha fazla göç eder.
Migrasyondaki farklılıklar, mikolik asit varyantlarının ayrı bantlara ayrılmasına neden olur.
Tamamlandıktan sonra, kurutulmuş plakaya bir fosfomolibdik asit lekesi püskürtün. Lipitlerin varlığında lekeyi azaltmak için plakayı ısıtın ve bantlara koyu yeşil bir renk verin.
Numuneleri TLC ile analiz etmek için, TLC odasının bir duvarını bir parça filtre kağıdı ile kaplayın. Hazneyi kapatmak için hazne köşelerine vazelin ekleyin. Çözücü karışımını filtre kağıdının üzerine boşaltın ve çözücünün kalan hacmini TLC haznesinin dibine ekleyin. TLC haznesini doyurmak için en az 20 dakika kapatın
Bu arada, cam tüpteki lipitleri 200 ila 1.000 mikrolitre kloroformda çözün ve 10 mikrolitre lipit-kloroform süspansiyonunu doğrudan TLC plakasına uygulamak için kılcal bir cam tüp kullanın. Numunenin beş dakika kurumasına izin verdikten sonra, plakayı doymuş TLC haznesine yerleştirin ve mobil fazın TLC'den geçmesine izin verin.
Çözücü, plakanın üst ucundan 1 santimetreye ulaştığında, silika tamamen kuruyana kadar plakayı laminer akı altına yerleştirin. Daha sonra, kurutulmuş plakaya etanol içinde 15 ila 20 mililitre% 10 Molibdatofosforik asit hidrat püskürtün, plaka parlak sarı olana kadar ve plakayı 120 santigrat derecede iki ila beş dakika ısıtın.