Heparin Afinite Kromatografisi Tabanlı Bakulovirüs Saflaştırması: Bakulovirüsü Böcek Hücresi Süpernatantından İzole Etmek İçin Bir Teknik

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyolojik Teknikler

0 görüntüleme • 3:40 dk • July 8th, 2025

Bakulovirüsler - çift sarmallı DNA virüsleri - GP64 gibi ana viral glikoproteinleri içeren bir zarfla çevrilidir.

Bakulovirüsleri, hücresel kalıntı ve kontamine edici proteinler içeren bir hücre kültürü süpernatantından izole etmek için, çapraz bağlı agaroz boncuklarından oluşan bir matris içeren bir heparin afinite kromatografi kolonunu birleştirin. Bu boncuklar, heparin zincirine negatif bir yük veren sülfat gruplarına sahip doğrusal bir polisakkarit olan heparine bağlanır.

Süpernatan yüklemesi sırasında maksimum bakulovirüs ve heparin etkileşimleri için uygun koşulları sağlamak üzere sütunu nötr pH'a ve optimum iyonik kuvvete sahip bir yıkama tamponu ile dengeleyin. Bakulovirüs içeren süpernatanı kolona yükleyin.

Bakulovirüs GP64'teki bazik amino asitler, negatif yüklü heparin ile spesifik olmayan elektrostatik etkileşimleri kolaylaştırır ve gevşek bir şekilde bağlanan kirleticilerin aksine kolona sıkıca bağlanır. Sütunu bir yıkama tamponu ile durulayın, bağlanmamış ve gevşek bağlı kirletici proteinleri ve kalıntıları temizleyin.

Yıkama tamponundan daha yüksek iyonik kuvvete sahip bir elüsyon tamponunu kolondan geçirin. Daha yüksek iyonik kuvvet, bakulovirüs-heparin elektrostatik etkileşimlerini bozar, bakulovirüsleri kolondan ayırır ve uzaklaştırır.

Akışta bakulovirüs içeren elüatı toplayın. Bakulovirüs süspansiyonunu hemen fizyolojik tuz konsantrasyonları içeren bir tamponla seyreltin ve virüs inaktivasyonunu önleyin. İzole edilen bakulovirüsler daha fazla analiz için kullanılabilir.

Yıkama tamponu hattını A1 giriş portundan en az 500 mililitre yıkama tamponu içeren bir şişeye yerleştirerek kromatografi sistemini kurun. Elüsyon tamponunu yüklemek için A2 tampon giriş portunu kullanın.

Kolon geçişli bakulovirüs süpernatanı, yıkama tamponu ve ayrıştırılmış bakulovirüsü toplamak için fraksiyon toplayıcıya birkaç 50 mililitrelik konik tüp yerleştirin. Heparin kolonunu, dakikada 7 mililitrelik doğrusal akış hızında, beş adet 7,9 mililitrelik kolon hacmi yıkama tamponu ile dengeleyin.

Dakikada 2 mililitrelik doğrusal akış hızında giriş numune portunun numune pompasını kullanarak heparin kolonuna 250 mililitre bakulovirüs süpernatanı yükleyin. Ardından, ultraviyole absorbans eğrisi taban çizgisine dönene ve stabil hale gelene kadar, dakikada 2 mililitrelik doğrusal bir akış hızında heparin kolonundan 10 kolon hacim yıkama tamponu çalıştırın.

Bakulovirüs partiküllerini heparin kolonundan dakikada 4 mililitrelik doğrusal bir akış hızında beş kolon hacmi elüsyon tamponu ile seyreltin. Bakulovirüs parçacıkları heparin kolonundan ayrıldığında kromatogramda proteinin keskin bir elüsyon zirvesini izleyin.

Elüsyon sonrası, sonraki santrifüjleme sırasında bakulovirüs partiküllerinin ozmotik şoktan inaktivasyonunu önlemek için 20 milimolar sodyum fosfat tamponu kullanarak ayrıştırılmış bakulovirüs süpernatantını hemen 10 kat seyreltin.

10:41

Bir GFP etiketli TMEM184A kullanarak Heparin Reseptör Kimliğinin Onay için Construct

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:50

Algılama ve kaldırma nükleaz kirlenme rekombinant prototip köpüklü virüs Integrase saflaştırılması sırasında

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:31

Baculovirus-Insect Hücre Kültürü Sistemi Kullanılarak Adeno-İlişkili Virüsün (AAV)2 Vektörün Üretimi ve Saflaştırılması için Süreç Geliştirme

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:00

SUMOylation Assay: İmmünoblotlama ile Substrat Proteinlerinin SUMOylation Durumunu Tespit Etmek İçin İn Vitro Bir Teknik

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:22

GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:45

Vitro SUMOylation SUMO E3 ligaz etkinlik eğitim için tahlil

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:11

Üretim ve Baculovirus arınma gen tedavisi uygulaması için

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:53

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:12

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:14

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 29 Ağustos 2026