$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Katyon değişim kromatografisi, net yüzey yüklerine bağlı olarak karışımlardan protein ayrılmasını kolaylaştırır.
Böcek hücresi protein lizatından hedef sinyal dönüştürücü protein izolasyonu için, diğer kirletici proteinleri içeren diyalize edilmiş bir hedef protein lizatı elde edin. Lizat viskozitesini azaltmak ve protein çözünürlüğünü artırmak için sodyum klorür içeren tampon ekleyin, bu da çalışma sırasında kromatografik kolon tıkanmasını önlemeye yardımcı olur.
Ek olarak, proteinin sıfır net yüke sahip olduğu hedef proteinin izoelektrik noktası olan pI'nin altındaki tampon pH, fazla hidrojen iyonlarının negatif karboksilat gruplarına bağlanmasını kolaylaştırarak hedef proteini pozitif yüklü hale getirir.
Negatif yüklü gruplara bağlanmış çapraz bağlı agaroz boncukları içeren kromatografik sütunu birleştirin. Sütunu dengelemek ve sütun-protein etkileşimlerini en üst düzeye çıkarmak için bağlayıcı tampon ekleyin. Seyreltilmiş lizatı dengelenmiş kolona yükleyin.
Daha pozitif yüklü hedef proteinler, daha az pozitif yüklü kirletici proteinlere göre kolonun negatif yüklü gruplarına etkileşime girer ve sıkıca bağlanır.
Bağlanmamış negatif yüklü kirletici proteinleri çıkarmak için sütunu tamponla yıkayın. Daha sonra, iyonik kuvvetini kademeli olarak arttırırken elüsyon tamponunu geçirin.
Düşük iyonik kuvvette, pozitif iyonlar ve proteinler arasında, sütundaki negatif gruplar için minimum rekabet vardır, zayıf bağlı, daha az pozitif yüklü kirletici proteinleri ayrıştırır. Bununla birlikte, iyonik kuvvet arttıkça, tuz iyonları sıkıca bağlı hedef sinyal dönüştürücü proteinlerle rekabet eder ve proteinler ile kolon arasındaki etkileşimleri azaltır ve bunları saflaştırılmış bir fraksiyon olarak ayrıştırır.
20 mililitrelik bir katyon değişim kolonunu, üç sütun hacmi Tampon G ile, ardından üç sütun hacmi Tampon F ile yıkayarak hazırlayın. Daha sonra, diyalize edilmiş numunenin 20 mililitresini, 20 mililitre Tampon E ekleyerek 100 milimolar nihai sodyum klorür konsantrasyonuna seyreltin ve numuneyi değişim kolonuna uygulayın.
Numunenin hepsini bir kerede değil, küçük bir miktarını seyreltmek çok önemlidir ve seyreltilmiş numuneler, proteinin çökelmesini sınırlamak için seyreltmeden hemen sonra kolona uygulanmalıdır.
Önceki seyreltme yükün sonuna yaklaştıkça sütunu taze seyreltilmiş numune ile yüklemeye devam edin. Ardından, sütunu, tipik olarak üç sütun hacmi gerektiren Tampon F ile taban çizgisi absorbansı 280'e kadar yıkayın.
Proteini, Tampon F'den %65 Tampon G'ye kadar 400 mililitrelik bir gradyanla kolondan kaldırın ve elüatı 6 mililitrelik fraksiyonlarda toplayın. Gradyan tamamlandıktan sonra, %65 Tampon G'den oluşan ek 1,5 sütun hacmi için sütunu yıkamaya devam edin.