Bakteri hücre dışı veziküllerin boyut dışlama kromatografisine dayalı ayrılması: Gram negatif bakteriyel dış zar veziküllerinin heterojen popülasyonunu boyutlarına göre ayırmak için bir teknik

Uygun kültür koşulları altında, gram negatif bakteriler, kargo taşıyan dış zar veziküllerini veya OMV'leri süpernatana salar. Bu veziküller, hücresel iletişime aracılık eden heterojen büyüklükte, küçük, küresel yapılardır.

OMV'lerin farklı büyüklükteki alt popülasyonlarını parçalamak için, matrisi desteklemek için tabanında uygun bir filtre bulunan boş bir boyut dışlama kromatografi sütunu alın.

Kolu, tanımlanmış gözenek boyutuna sahip kimyasal olarak inert, küresel boncuklardan oluşan jel filtrasyon matrisi ile paketleyin ve boyutun büyük boyutlu OMV'lerin girmesini önlemek için en uygun olduğundan emin olun. Optimum saflaştırma için boncukların kurumasını önlemek için sütunu uygun bir tamponla dengeleyin.

Farklı boyutlarda OMV'lerin, protein agregatlarının ve nükleik asitlerin alt popülasyonlarını içeren bakteri kültürü süpernatantını kolonun üstüne yükleyin. Numunelerin yerçekimi kuvveti ile çalışmasına izin verin.

Numuneler kolondan geçerken, gözeneklere giremeyen daha büyük OMV'ler, önce ayrıştırılmak için jel boncuklar arasındaki parçacıklar arası boşluklardan geçer. Bu arada, daha küçük OMV'ler matris gözeneklerine nüfuz eder, daha uzun bir yol izler ve daha sonra elüte olur.

Daha küçük boyutları nedeniyle, protein agregatları ve nükleik asitler matristeki çeşitli gözeneklere girer ve bu da kolonda en uzun tutma süresine sahip olmalarına ve son fraksiyonlar olarak elüte olmalarına neden olur. Ayrı OMV elüatları toplayın ve daha fazla analiz için saklayın.

Başlamak için, bir stok jel filtrasyon ortamı şişesini karıştırmak için bir cam çubuk kullanın ve sütunu doldurmak için gereken hacmi ve yaklaşık% 50 fazlalığı bir cam şişeye dökün. Boncukların oturmasına izin verin ve fazla sıvıyı boşaltın. Elüsyon tamponundaki boncukları yaklaşık% 70 jel ve% 30 tampondan oluşan nihai bir çözeltiye yeniden süspanse edin ve çözeltiyi vakum altında gazdan arındırın.

Kolonu dikey konumda bir halka standına monte edin ve tamponu sadece yaklaşık 1 santimetre kalana kadar boşaltmadan önce duvarları ıslatmak için kolonu elüsyon tamponu ile doldurun. Ardından, jel boncukları dikkatlice kolona pipetleyin ve aynı anda boncukların çökelmesini önlemek için fazla tamponu boşaltın, kolon kolon rezervuarının tabanının yaklaşık 2 santimetre altında bir yüksekliğe kadar paketlenene kadar.

Numuneyi yüklemeden önce, elüsyon tamponunun gazını vakum altında alın. Kolonu kolon hacminin yaklaşık iki katı elüsyon tamponu ile yıkayın. Tampon jel tabakasının tepesine ulaştığında, yüzeyi bozmadan jel tabakasının üstüne litre başına 100 ila 200 nanomol 2 mililitre dış zar vezikül numunesini dikkatlice ekleyin ve numunenin jele girmesine izin verin.

Yavaş yavaş, jel tabakasını bozmadan elüsyon tamponunu kolona ekleyin ve kolonun altına 50 mililitrelik bir tüp yerleştirin. Kolonun kurumasını önlemek için, aynı anda kolonun üstüne elüsyon tamponu ekleyin.

20 mililitre elüat topladıktan sonra, kolonun altına 1,5 mililitrelik tüplerden oluşan bir raf yerleştirin. Her tüpte toplam 96 adet 1 mililitrelik fraksiyon toplayın. Numuneleri toplarken, kolona sürekli olarak elüsyon tamponu ekleyin. Sütunu temizlemek için, sütundan 1 sütun hacmi 0.1 molar sodyum hidroksit geçirin, ardından 2 sütun hacmi elüsyon tamponu çalıştırın.