JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyolojik Teknikler
0 görüntülenme • 3:46 dk. • July 8th, 2025
Antikor-ilaç konjugatları - ADC'ler - hedefe özgü bir monoklonal antikorun uygun bağlayıcılar aracılığıyla sitotoksik ilaçlarla bağlanmasıyla oluşturulur. Stokastik konjugasyon işlemi, farklı sayıda ilaç parçasına sahip ADC'ler oluşturur.
ADC türleri, terapötik etkinliklerini belirleyen ilaç-antikor oranları veya DAR ile karakterize edilir. ADC'lerin hidrofobikliği, onları hidrofobik etkileşim, sıvı kromatografisi veya HIC bazlı karakterizasyon için uygun adaylar haline getirir.
Başlamak için, agaroz matris bazlı sabit faz içeren bir kromatografi kolonunu monte edin. Matris, hidrofobik alkil fonksiyonel grupları olan butil kısımlarına çapraz bağlıdır. Sütunu yüksek tuz bağlama tamponu ile dengeleyin. ADC çözeltisini sütuna yükleyerek takip edin.
Tampondaki tuz iyonları, ADC'lerin etrafındaki su moleküllerinin yerini alarak hidrofobik bölgelerini açığa çıkarır. Bu, ADC'lerin hidrofobik etkileşimler yoluyla bütil ligandlarına bağlanmasını sağlar. Daha fazla sayıda bağlı ilaç parçasına sahip ADC'ler, kolon ile daha güçlü etkileşim gösterir.
Yüksek tuz tamponunu, düşük tuz konsantrasyonuna sahip elüsyon tamponu ile yavaşça değiştirin. Tuz konsantrasyonunu kademeli olarak azaltma işlemi, gradyan elüsyonu olarak adlandırılır.
Tuz iyonlarındaki azalma, su moleküllerinin ADC'leri çevrelemesini sağlayarak ligandlarla etkileşimlerini bozar. En düşük sayıda bağlı ilaç parçasına sahip ADC'ler önce ayrıştırılır, ardından daha yüksek DAR'a sahip türler gelir.
ADC'leri DAR'larına göre karakterize etmek için elüsyonu izleyin.
Eşleniği analiz etmek için, HPLC-HIC kolonunu 5 dakika boyunca %100 yüksek tuzlu tampon ile dengeleyin. Daha sonra, MMAE'ye bağlı 1 mg / mL trastuzumab çözeltisinin 15 mikrolitresini bir şişede 15 mikrolitre 2X yüksek tuz tamponu ile karıştırın. Karışımı HPLC kolonuna enjekte edin. Bir dakika boyunca% 100 yüksek tuz tamponu ile izokratik 1 mL / dak akışta elute edin.
Bunu, düşük tuzlu tamponda %100 ila %0 arasında yüksek tuzlu tamponda 15 dakikalık bir gradyanla takip edin. Elüsyonu 280 nanometrede izleyin. Kromatogramdaki tepe noktalarını, sırasıyla sıfır, bir ve iki konjuge toksin içeren trastuzumab'a karşılık gelen 7.5, 9.2 ve 11.5 dakikalık tutma süreleriyle entegre edin.
Şimdi, ağırlığı 9.2 olan 1 dakika ve ağırlığı 10.5 olan 2 dakika olan tepe noktalarının alanlarını toplayarak DAR'ı hesaplayın ve üç zirvenin toplam alanına bölün.